Гібридизація in situ із флуоресцентною міткою (FISH). Флуоресцентна гібридизація in situ (FISH) Метод флуоресцентної гібридизації in situ

Традиційна цитогенетикащодо каріотипу завжди була обмежена бендовим рівнем дозволу. Навіть при використанні високороздільних методів диференціального фарбування хромосом ми лише виявляли більшу кількість бендів на хромосомі, але не були впевнені, що добираємося до молекулярного рівня дозволу. Останні досягнення ДНК-технологій та цитогенетики уможливили використання методів FISH для аналізу змін хромосомної ДНК на молекулярному рівні. Молекулярна цитогенетика забезпечила революційний прорив у цитогенетиці, дозволивши:

Здійснювати аналіз структури ДНК хромосом у діапазоні 10-100 кг;
проводити діагностику інтерфазних клітин, що не діляться, що вплинуло на пренатальну діагностику і преимплантационную генетичну діагностику (ПГД).

Технологія FISHвикористовує ДНК-зонд, що зв'язується або ренатурує специфічні послідовності ДНК усередині хромосоми. Денатурований зонд інкубується з нативної ДНК клітини, також денатурованої до одноланцюгового стану. Зонд замінює біотин-дезоксіурідінтріфосфат або дигоксигенін-урідінтрифосфат на тимідин. Після ренатурації зондом нативної ДНК комплекс «зонд-ДНК» можна виявити при додаванні міченого флюорохромом авідину, що зв'язується з біотином, або міченого антидігоксигеніну флюорохромом. Додаткове посилення сигналу можна отримати, додавши антиавідин і вивчивши комплекс за допомогою флюоресцентної мікроскопії. Помітивши декількома різними флюорохромами різні ДНК-зонди, можна одночасно візуалізувати кілька хромосом або хромосомних сегментів усередині однієї клітини у вигляді кольорових сигналів.

Можливість визначення специфічних генних сегментів, наявних або відсутніх на хромосомах, дозволила діагностувати синдроми генних послідовностей на рівні ДНК, як, втім, і транслокації в інтерфазних ядрах, найчастіше - в окремих клітинах.

Матеріалом для FISHможуть служити або метафазні хромосоми, отримані з клітин, що діляться, або інтерфазні ядра з клітин, що не знаходяться в стадії поділу. Зрізи попередньо обробляють РНКазою та протеїназою для видалення РНК, яка може вступати в перехресну гібридизацію із зондом та хроматином. Потім їх нагрівають у формаміді, щоб денатурувати ДНК, і фіксують крижаним спиртом. Потім зонд готують до гібридизації шляхом нагрівання. Після цього зонд та хромосомний препарат змішують та герметизують покривним склом при 37 °С для гібридизації. Змінюючи температуру інкубації або сольовий склад розчину для гібридизації, можна підвищити специфічність зв'язування та зменшити фонове маркування.

Застосування флюоресцентної гібридизації in situ - технології FISH

Ефективність технології FISHвперше була продемонстрована при локалізації генів на . З використанням методу флюоресцентного мічення, гібридизація in situ виявилася незамінною для діагностики хромосомних аномалій, які не виявляються традиційними методами бендингу. FISH також відіграла ключову роль у скоєнні одного з найнезвичайніших відкриттів сучасної генетики – геномного імпринтингу.


Свій розвиток технологія FISHнабула у трьох формах. Центромірні, або альфа-сателітні, зонди характеризуються відносною хромосомною специфічністю, їх найчастіше використовували в генетиці інтерфазних клітин. Ці зонди генерують до певної міри дифузні сигнали адекватної сили в області центроміри, але не вступають у перехресну гібридизацію з хромосомами, що мають аналогічні центромірні послідовності. В даний час розроблені однокопійні зонди, що дають дискретний сигнал від специфічного бенду хромосоми і дозволяють уникнути феномена перехресної гібридизації. Ці зонди також можна використовувати для визначення копійності та специфічних регіонів хромосоми, ймовірно пов'язаних з тим чи іншим синдромом. Однокопійні та центромірні зонди, розроблені для хромосом 13, 18, 21, X та Y, використовують для пренатальної діагностики.

Можливе також «фарбування» цілих хромосом за допомогою FISH. Завдяки технології спектрального каріотипування, при якій використовують суміш різних флюорохромів, тепер стало можливим створення унікального флюоресцентного патерну кожної окремої хромосоми з 24 окремими кольорами. Ця технологія дозволяє визначати складні хромосомні перебудови, які не видно при використанні традиційних цитогенетичних методик.

Метод FISHу пренатальній діагностиці. Для жінок старшого репродуктивного віку вагітність може стати приводом не так для радості, як для занепокоєння. З віком жінки пов'язаний ризик розвитку хромосомних аномалій плода. Амніоцентез, що здійснюється на 16 тижні вагітності, з подальшим аналізом каріотипу займає 10-14 днів. Використання FISH у попередньому обстеженні дозволяє прискорити діагностику та зменшити час очікування. Більшість генетиків та лабораторій дотримуються думки, що метод FISH не слід використовувати ізольовано для ухвалення рішення про подальше ведення вагітності. Метод FISH обов'язково слід доповнювати каріотиповим аналізом, і його результати як мінімум повинні корелювати з патологічною картиною ультразвукового дослідження (УЗД) або біохімічного скринінгу крові матері.

Синдроми генних послідовностейвідомі також під назвою синдромів мікроделеції або сегментарної анеусомії. Це делеції суміжних фрагментів хромосоми, що залучають, як правило, багато генів. Синдроми генних послідовностей були вперше описані 1986 р. з використанням класичних методик цитогенетики. Тепер, завдяки FISH, можлива ідентифікація субмікроскопічної делеції на рівні ДНК, що дозволило виявляти найменший делецьований регіон, пов'язаний з розвитком того чи іншого синдрому, який отримав назву критичного регіону. Після визначення критичного регіону для синдрому найчастіше стає можливим ідентифікувати специфічні гени, відсутність яких визнають асоційованим із цим синдромом. У керівництві, що нещодавно, по синдромах генних послідовностей повідомляють про 18 синдромів делеції і мікроделеції, асоційованих з 14 хромосомами. Деякі найчастіше зустрічаються синдроми генних послідовностей та його клінічні прояви наведено у табл. 5-2.

Теломери- Утворення, що прикривають з кінців довгі і короткі плечі хромосом. Вони складаються з повторюваних послідовностей TTAGGG і запобігають злиттю кінцевих ділянок хромосом між собою. Тіломірні зонди відіграють важливу роль у розпізнаванні комплексних транслокацій, які неможливо визначити традиційними цитогенетичними методами. Крім того, одним із відкриттів Проекту «Геном людини» був той факт, що регіони хромосом, що прилягають до тіломерів, багаті на гени. Нині показано, що субмикроскопические субтеломерные делеції відповідальні виникнення багатьох генетично обумовлених захворювань.

Коротка відповідь: Метод флюоресцентної гібридизації in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization) включає застосування унікальних нуклеотидних послідовностей ДНК як зонд для пошуку потрібних послідовностей ДНК у матеріалі, отриманому від пацієнта. Метод заснований на комплементарному зв'язуванні ДНК-зонда з ДНК метафазних хромосом або інтерфазних клітин. ДНК-зонд та досліджувану ДНК денатурують, утворюється одноланцюжкова ДНК. ДНК-зонд додають до препарату хромосом, інкубують певний час. Присутність або відсутність міченого флюорохромом зонда у складі ДНК після гібридизації визначається для дослідження хромосом за допомогою флюоресцентної мікроскопії.

Розгорнута відповідь: Метод флуоресцентної гібридизації in situдозволяє виявляти індивідуальні хромосоми або їх окремі ділянки на метафазних препаратах хромосом або інтерфазних ядрах на основі комплементарної взаємодії ДНК-зонда, кон'югованого з флуоресцентною міткою та шуканої ділянки на хромосомі. Для візуалізації на хромосомі пептидно-нуклеїнових сполук застосовують PNA-зонди на основі білкового продукту.
Метод заснований на комплементарному зв'язуванні ДНК-зонда з ДНК метафазних хромосом або інтерфазних клітин і включає наступні етапи:
1. Денатураціядволанцюгової ДНК зонда та ДНК мішені до одноланцюгових під впливом високої температури або хімічних агентів.
2. ГібридизаціяДНК-зонда з ДНК-мішенню за принципом комплементарності з утворенням дволанцюжкової гібридної молекули
3. Постгібридизаційне відмиваннядля видалення ДНК-зонда, що не гібридизувався.
4. Аналізгібридизаційних сигналів з люмінісцентним мікроскопом

Перевагиметоду молекулярно-генетичної діагностики FISH включають швидкий аналіз великого числа клітин, високу чутливість і специфічність, можливість досліджувати клітини, що не культивуються і неділяться.
Недолікиметоду полягають у неможливості отримати інформацію про фізичному станідосліджуваної ДНК чи ділянки хромосоми.
FISH застосовують у пренатальній молекулярно-генетичній діагностиці та для характеристики пухлин; у педіатричній практиці його використовують, як правило, для ідентифікації субмікроскопічних делецій, асоційованих зі специфічними вадами розвитку. Синдроми, основу яких лежать мікроделеції, раніше вважалися захворюваннями невідомої етіології, оскільки хромосомні делеції і перебудови, що викликають розвиток цих захворювань, зазвичай не візуалізуються при традиційних методах хромосомного аналізу. Такі дрібні делеції у специфічних ділянках хромосом можна з великою точністю виявити методом FISH. До захворювань, зумовлених субмікроскопічними делеціями, належать синдроми Прадера-Віллі, Ангельмана, Вільямса, Міллера-Дікера, Сміт-Мадженіс та велокардіофаціальний синдром. FISH полегшує діагностику цих синдромів у нетипових випадках, особливо в дитячому віці, коли ще немає багато діагностично значущих ознак захворювання. Застосування цього методу молекулярно-генетичної діагностики доцільно також у підлітковому та дорослому віці, коли типові клінічні ознаки захворювання, характерні для дитячого віку, зазнають змін.

121. ДНК-зонди. Їх застосування у визначенні спадкових захворювань.

Короткий огляд

ДНК – зонд - цекороткий фрагмент ДНК, кон'югований з флуоресцеїном, ферментно або радіоактивним ізотопом, який використовується для гібридизації з комплементарною ділянкою молекули ДНК - мішені.

Основна частина

Системи ДНК-діагностики

Інформація про все різноманіття властивостей організму міститься у його генетичному матеріалі. Так, патогенність бактерій визначається наявністю у них специфічного гена чи набору генів, а спадкове генетичне захворювання виникає внаслідок пошкодження певного гена. Сегмент ДНК, що детермінує даний біологічний ознака, має певну нуклеотидну послідовність і може служити діагностичним маркером.

В основі багатьох швидких та надійних діагностичних методів лежить гібридизація нуклеїнових кислот – спарювання двох комплементарних сегментів різних молекул ДНК. Процедура загалом полягає в наступному.

1. Фіксація одноланцюгової ДНК-мішені на мембранному фільтрі.

2. Нанесення міченої одноланцюгової ДНК-зонда, яка за певних умов (температури та іонної сили) спарується з ДНК-мішенню.

3. Промивання фільтра для видалення надлишку міченої ДНК-зонда, що не зв'язалася.

4. Детекція гібридних молекул зонд/мішень.

У діагностичних тестах, заснованих на гібридизації нуклеїнових кислот, ключовими є три компоненти: ДНК-зонд, ДНК-мішень та метод детекції гібридизаційного сигналу. Система детекції має бути надзвичайно специфічною і високочутливою.

*Флуоресцеїн (діоксифлуоран, уранін А) - органічна сполука, флуоресцентний барвник. У аналітичної хіміїфлуоресцеїн використовується як люмінесцентний кислотно-основний індикатор. У біохімії та молекулярній біології ізотіоціанатні похідні флуоресцеїну в якості біологічних фарб для визначення антигенів та антитіл.

* Детекція – це виявлення, виявлення, знаходження чогось.

*кон'югування = сполучення

*Якщо в одній "пробірці" провести плавлення та відпал суміші ДНК, наприклад, людини та миші, то деякі ділянки ланцюгів ДНК миші будуть з'єднуватися з комплементарними ділянками ланцюгів ДНК людини з утворенням гібридів. Число таких ділянок залежить від ступеня спорідненості видів. Чим ближчі види між собою, тим більше ділянок комплементарності ниток ДНК. Це явище називається гібридизація ДНК-ДНК.

122. Методи та умови застосування прямої ДНК-діагностики.

Короткий огляд:

За допомогою прямих методів виявляються порушення первинної нуклеотидної послідовності ДНК (мутації та їх типи). Прямі методи відрізняються точністю, що досягає майже 100%.

Метою прямої діагностики є ідентифікація мутантних алелів (порушення первинної нуклеотидної послідовності ДНК, мутації та їх типи).

Недоліком методу прямої ДНК-діагностики є необхідність знання точної локалізації гена та спектра його мутацій. Методи прямої ДНК-діагностики показані для таких захворювань, як фенілкетонурія (мутація R408W), муковісцидоз - (найчастіша мутація delF508), хорея Гентінгтона (експансія тринуклеотидних повторів-CTG-повтори) та ін.

Повна відповідь:

За допомогою прямих методів виявляються порушення первинної нуклеотидної послідовності ДНК (мутації та їх типи). Прямі методи відрізняються точністю, що досягає майже 100%. Однак на практиці зазначені методи можуть застосовуватись за певних умов:

1) відомої цитогенетичної локалізації гена, відповідального за розвиток спадкового захворювання,

2) має бути клонованим ген захворювання та відома його нуклеотидна послідовність.

Метою прямої діагностики є ідентифікація мутантних алелів (порушення первинної нуклеотидної послідовності ДНК, мутації та їх типи). Висока точність методу прямої ДНК-діагностики в більшості випадків не вимагає ДНК-аналізу всіх членів сім'ї, оскільки виявлення мутації у відповідному гені дозволяє майже зі 100-відсотковою точністю підтвердити діагноз та визначити генотип усіх членів сім'ї хворої дитини, включаючи гетерозиготних носіїв.

Недоліком методу прямої ДНК-діагностики є необхідність знання точної локалізації гена та спектра його мутацій.

Методи прямої ДНК-діагностики показані для таких захворювань, як фенілкетонурія (мутація R408W), муковісцидоз - (найчастіша мутація delF508), хорея Гентінгтона (експансія тринуклеотидних повторів-CTG-повтори) та ін.

Однак до теперішнього часу гени багатьох захворювань не картовані, невідома їхня екзонно-інтронна організація, і багато спадкових хвороб відрізняються вираженою генетичною гетерогенністю, що не дозволяє повною мірою використовувати прямі методи ДНК-діагностики. Тому інформативність методу прямої ДНК-діагностики широко змінюється. Так, при діагностиці хореї Гентінгтона, ахондроплазії вона становить 100 %, при фенілкетонурії, муковосицидозі, адреногенітальному синдромі – від 70 до 80 %, а при хворобі Вільсона-Коновалова та міопатії Дюшенна/Бекера – 45-60. У зв'язку з цим використовуються опосередковані методи молекулярно-генетичної діагностики спадкових хвороб.

Можливості гібридизації in situ можуть бути значно підвищені за рахунок одночасного використання кількох флуоресцентних кольорів. Багатоколірна флуоресцентна гібридизація in situ (FISH) у своєму найпростішому варіанті може бути використана для маркування (фарбування) багатьох характеристик, оскільки в гібридизації застосовуються різні флуорофори. При використанні не одних кольорів, а їх комбінацій за допомогою мікроскопів із цифровою обробкою зображень в окремих клітинах можна одночасно виявляти набагато більше виділених барвниками характеристик.

Мал. 1. Багатобарвна FISH

Для детального ознайомлення з флуоресцентними мікроскопами основних світових виробників оптичних систем та супутнього обладнаннявідвідайте наш каталог або зв'яжіться з нашими фахівцями та отримайте повну професійну консультацію з будь-яких питань, що є у Вас.

На малюнку 1 представлений типовий зразок багатобарвної гібридизації флуоресцентної - FISH. Нормальні чоловічі лімфоцити були гібридизовані з FITC-біотином, пофарбованим Chr2l та ChrY зондами, та CY3-дигоксигеніном, пофарбованим Chrl3 та ChrY зондами. Вгорі зліва - знімок ядер ДНК, пофарбованих ДАПІ, отриманий за допомогою ДАПІ фільтра. Вгорі справа - знімок Chr2l і ChrY, пофарбованих FITC, отриманий за допомогою FITC-фільтра. Внизу зліва - знімок Chrl3 та ChrY, пофарбованих CY3, отриманий за допомогою CY3 фільтра. Нижній правий знімок є комбінованим зображенням, на якому у кольорі представлені всі хромосоми-мішені. Цей зразок був наданий доктором Тімом Хоузілом, Інтегрейтід генетікс, Фрамінхем, Массачусетс.

Техніка багатобарвної FISH, об'єднана з методами цифрової обробки зображень, на сьогодні пропонує рівних можливості неізотопного виявлення множинних послідовностей нуклеїнових кислот для аналізу компонентів клітин, хромосом і генів.

Флуоресценція - явище, за якого хімічне з'єднаннязбуджується на одній довжині світлової хвилі, а випромінює на іншій, зазвичай більшій – застосовується у всіх біологічних науках для вивчення різноманітних структур та внутрішньоклітинних процесів. Технологічні успіхи у створенні барвників та мікроскопів призвели за останнє десятиліття до швидкого розвитку флуоресцентних методів.

У цій оглядовій статті будуть викладені основи FISH-методу, обмеження, з якими зіткнулися дослідники за роки застосування FISH, останні розробки апаратного та програмного забезпечення, барвників та реагентів, що вплинули на розвиток цього методу, та поточні напрямки у цій галузі. Нові досягнення цього методу, що призвели до його застосування не тільки в дослідницьких лабораторіях, а й у клінічній діагностиці, також будуть розглянуті в цій статті.

Огляд методу FISH

Застосування FISH стрімко зростає в геноміці, цитогенетиці, пренатальних дослідженнях, біології новоутворень, радіоактивному маркуванні, генному картуванні, ампліфікації генів та основних біомедичних дослідженнях. У принципі цей метод досить простий.

Гібридизацією ідентифікуються, або позначаються, геномні послідовності-мішені, таким чином, що можна спостерігати їх місцезнаходження та розмір. Послідовності ДНК або РНК із відповідних, залежно від хромосоми, зондів спочатку позначаються репортерними групами, які пізніше ідентифікуються за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Позначений ДНК або РНК зонд потім гібридизується з метафазними хромосомами або ядрами на предметному склі. Після промивання та посилення сигналу зразок досліджується за репортерними групами за допомогою флуоресцентної мікроскопії.

FISH дозволяє досягати дуже високого просторового дозволу морфологічних та геномних структур. Цей метод досить швидкий, простий у здійсненні та характеризується високою стабільністю барвників. Залежно від використовуваного зонда можна визначити геном окремої особини, цілі хромосоми, ділянки хромосом та послідовність унікальних копій.

колишні обмеження

Донедавна FISH була обмежена апаратним та програмним забезпеченням, реагентами, технологією отримання барвників та високою вартістю виконання. Апаратні засоби для мікроскопів, що серійно випускаються, оптимізовані для багатобарвної FISH, були недоступні до середини 1990-х років. До цього мікроскопи доводилося спеціально налаштовувати додатків FISH. Більшість мікроскопічної оптики не були призначені для виявлення світлових сигналів. низького рівня, Характерні для FISH. Оскільки при використанні цього методу суттєво покращився дозвіл геномів, зросли й вимоги до мікроскопічної оптики. Представляли проблему та хроматичні аберації на багатьох довжинах хвиль. Для багатобарвного аналізу особливо, всі лінзи, включаючи лінзу, що збирає, повинні були мати корекцію хроматичних аберацій. До того ж дуже важко було налаштовувати епіфлуоресцентні джерела світла для отримання рівномірного освітлення.

Аналіз знімків багатобарвної FISH вимагає поділу різних сигналів або (а) окремими фільтр-кубами, або (b) використанням насадки світлофільтрів збудження з широкосмуговими дихроїчними та пороговими фільтрами. Розвиток технології фільтрів виправило деякі колишні проблеми, спричинені оптичною неспіввісністю та роз'юстуванням, що викликаються механічним перемиканням між окремими фільтр-кубами. Змінні фільтри світла збудження, які застосовуються з багатосмуговими дихроїчними та пороговими фільтрами, можуть ефективно працювати з трьома кольорами при використанні окремих фільтрів збудження для кожного кольору без реєстрації зсуву. Але при роботі більш ніж з трьома кольорами все ж таки треба використовувати односмугові фільтри.

Для збору даних використовувалися високочутлива кольорова плівка або ПЗЗ (прилад із зарядним зв'язком), і в обох випадках були проблеми з точністю передачі кольору. На додаток, були проблеми з накладання зображень різних кольорів, знятих з одного зразка із застосуванням різних барвників-зондів.

Програмне забезпечення для кількісного аналізу зразків, приготовлених за допомогою флуоресцентних реагентів, також бажало кращого, оскільки існуючі системи аналізу зображень не були оптимізовані для роботи з флуоресцентними зразками вибірки. Візуальний аналіз є трудомісткою та часто суб'єктивною процедурою, тому без використання передових досягнень флуоресцентної візуалізації аналіз флуоресцентних вибірок був важким і допускав подвійне тлумачення. Дослідникам зазвичай доводилося мати у штаті своїх програмістів розробки своїх програм для аналізу зображень.

Самих реагентів та барвників було недостатньо для всіх програм. Наприклад, ефективність визначення місця гібридизації падала зі зменшенням розміру зонда, що накладало серйозні обмеження на зразки, які можна спостерігати флуоресцентною мікроскопією. Число різних флуоресцентних барвників було обмежено; до того ж вони мали невисоку фотостабільність. Але розвиток технології флуоресцентних барвників і супутніх технологій у рамках федерального проекту «Геном людини» зараз приносять свої плоди. Вже існують зонди всім хромосом людини, і навіть зростає кількість доступних зондів генів. Набори для гібридизації in situ та флуоресцентно-відзначені зонди сьогодні серійно випускаються кількома компаніями.

Ціна була ще однією серйозною перешкодою. Оскільки на ринку не було систем, що серійно випускаються, дослідникам доводилося збирати системи, що отримуються на замовлення, включаючи реагенти, зонди, мікроскоп, апаратне та програмне забезпечення з обробки зображень, аналізу даних та розробки звітів. Проведення багатобарвної FISH з комплексним аналізом зображення могло коштувати досліднику понад $200 000 - сума важкодоступна більшості клінічних дослідників. В результаті, багато дослідників, які бажають використовувати FISH у своїх лабораторіях, не мали такої можливості.

FISH стала широко доступною

Багато виробників апаратного та програмного забезпечення розробили доступні системи, що серійно випускаються, як альтернативу системам на замовлення. Атмосфера співробітництва, що виникла серед багатьох фірм та лабораторій, що займаються FISH, призвела до нових проривів у цій галузі. І свої досягнення автори робіт, що публікуються, розглядають саме в рамках такого співробітництва.

Мал. 2. Робочий екран програми MultiFluor

Система, що працює в Сполучених Штатах та забезпечує середні ціни для серійно випускаються для досліджень FISH систем, об'єднує компоненти багатьох виробників і покладається на останні досягнення в програмній обробці зображень, апаратному забезпеченні мікроскопів та інших аксесуарів. Для клінічних дослідницьких лабораторій ця система виявляється корисною у багатьох додатках. Будучи інтегрованою та автоматизованою, вона дозволяє проводити клінічні випробування в повному обсязі.

Система програмного забезпечення, представлена ​​тут - MultiFluor™ - багатопараметрична система візуалізації (Системи дослідження біологічних структур), розроблена на базі Microsoft® Windows (корпорація Майкрософт, Беллевуе, Вашингтон) та призначена для виявлення, аналізу та подання структурних та молекулярних характеристик, отриманих за вибірками багатобарвної FISH. Час аналізу та точність результатів покращено завдяки співвіднесенню багатьох характеристик на різних довжинах хвиль у кожній вибірці. Ця система полегшує отримання зображення, його зберігання, керування базою даних, автоматичне керування мікроскопом та повнофункціональний графічний аналіз даних.

На малюнку 2 зображено екран із оглядовим поданням даних програми MultiFluor. Користувачі можуть переглянути знімки та відповідні їм дані, зіставити багатопараметричні дані, отримані в різних кольорах (на різних довжинах хвиль) за допомогою різних інструментів графічної побудови, включаючи гістограми, діаграми розсіювання тощо. Тут різні графіки показані разом з набором кольорових знімків клітини (зображують ДАПІ-ядра, FITC-ChrX, CY3-ChrY та CY5-Chr2l), поряд з вихідними даними, представленими в таблиці.

Дослідники FISH мають можливість автоматично отримувати знімки на різних довжинах хвиль у різних фокальних площинах, візуалізувати зонди багатобарвної FISH, постачати знімки примітками та роздруковувати їх, зберігати та витягувати великі обсяги даних наборів кольорових зображень. Метафазні хромосоми багатобарвної FISH можуть бути проаналізовані генним картуванням за допомогою порівняльної геномної гібридизації (СГГ), а також генерацією каріотипів. Вибрані зразки можуть бути проскановані та проаналізовані. Програма автоматично фокусує систему, отримує знімки на багатьох довжинах хвиль, запам'ятовує положення клітин на предметному склі, вимірює різні характеристики, включаючи підрахунок зонда, інтенсивність флуоресценції та морфометрію клітини. Різні характеристики різних довжинах хвиль може бути співвіднесені друг з одним.

Додатковою характеристикою системи є можливість її роботи з персональними комп'ютерами(ПК), об'єднаними у мережу. У типовій конфігурації один комп'ютер є онлайновою станцією, з'єднаною з апаратним забезпеченням камери та мікроскопа. Цей комп'ютер керує отриманням знімків та здійснює миттєвий аналіз. Інші ПК є вторинними станціями аналізу інформації, де обробляються дані, що надійшли з першого ПК, або де автономно виконується спеціальний аналіз.

Програма дозволяє представити всі компоненти у яскравих псевдоцвітах для одночасної багатобарвної візуалізації. Наприклад, одночасні знімки чотириколірного експерименту (з використанням ДАПІ (синій), FITC (зелений), CY3 (червоний), і комбінації FITC-CY3 (жовтий)) можуть бути представлені окремо або об'єднані в одне зображення (як показано на малюнку 1) . Кожен знімок може бути інтерактивно посилений для виділення цікавих характеристик. За допомогою програми легко створювати гістограми, діаграми розсіювання, таблиці, лінійні графіки та інші форми подання та оцінки даних (рисунок 2). До того ж дані зберігаються у легко доступних та популярних форматах, таких як TIFF, JPEG, GIF та інші.

Онкологічні, пренатальні та біологічні дослідження

Описувані FISH системи розроблені для забезпечення більшої доступності дослідникам, ніж колишні, що виготовляються на замовлення. Вони все більше застосовуються в онкології, вивченні патологій, цитогенетиці та біології розвитку. Серед їх додатків такі, як аналіз інтерфазних клітин за кількістю плям під час спостереження з багатобарвними барвниками, імунофенотипування, морфометрія клітини та склад ДНК.

За допомогою цих систем проводиться аналіз відхилень серед копій хромосом, співвіднесених із загальним складом ДНК, які пов'язані з утворенням пухлин. сечового міхура. У пренатальних дослідженнях ці системи можуть використовуватися для виявлення анеуплоїдій у ядрах, що покоїться, пов'язаних з пренатальними дефектами, включаючи синдром Дауна, синдром Тернера, синдром Клайнфельтера та іншими. У клітинній біології та біології розвитку ця система може використовуватися для картування маркерів поверхні клітини та їх відносного розподілу, таких як рецептори, маркерів цитоплазми, включаючи цитоскелетні білки, інформаційні РНК та специфічні гени.

Діагностичний потенціал

За останні півтора десятиліття стало зрозуміло, що FISH метод має надзвичайно великий потенціал не лише як інструмент у дослідницької роботи, але й у клінічній діагностиці у таких галузях, як пренатальна діагностика, цитогенетика та розвиток пухлин. Відсутність високоякісних, доступних за ціною систем не тільки гальмувала поширення FISH серед дослідників, але робила цей метод недосяжним для діагностичних центрів багатьох медичних установ.

Результати, які раніше могли бути отримані лише за допомогою дорогого, виготовленого на замовлення обладнання, зараз можуть бути отримані за допомогою цієї системи - і це одна з найважливіших її переваг. Мрія застосувати FISH не тільки для ширшого кола біомедичних досліджень, а й прямо поставити її на службу пацієнтам, можливо, стане реальністю в недалекому майбутньому.

Флуоресцентна стереомікроскопія

Епіфлуоресцентне освітлення

Донедавна флуоресцентне освітлення було доступне лише на дослідницьких мікроскопах, обладнаних спеціальними світлосильними об'єктивами. Необхідність стереомікроскопії у цій методиці посилилася з появою генетично кодованих та біологічно специфічних флуоресцентних білків, таких як GFP (зелений флуоресцентний білок).

Мал. 1. Стереомікроскоп з епіфлуоресцентним освітлювачем

Застосування стереомікроскопів для спостереження GFP настільки поширене, що стерео-флуоресцентні освітлювачі частіше називаються GFP-освітлювачами, незважаючи на те, що вони можуть використовуватися в багатьох інших додатках, як у біологічних науках, так і в електронній промисловості. Великі зразки, такі як личинки, нематоди, смугастий даніо, ооцити та зрілі комахи легко спостерігати (і ними легко маніпулювати), якщо вони пофарбовані GFP та висвітлюються світлом флуоресценції. Флуоресцентне освітлення виявляє, які організми виробляють флуоресцентний білок, а стереоскопічний спосіб спостереження, у поєднанні з великим полем зору та великою робочою відстанню, дозволяє спостерігачеві користуватися під час експерименту пінцетом, піпетками або мікроманіпуляторами. Інші, більш типові зразки також легко досліджувати за допомогою стереомікроскопів з флуоресцентним освітленням.

Освітлювач для епіфлуоресценції на стереомікроскопі функціонує подібно до тих, які встановлені на більш складних мікроскопах. Зазвичай флуоресцентний освітлювач являє собою ксенонову або ртутну дугову лампу, поміщену у зовнішній блок освітлювача, який з'єднується мікроскопом через проміжний тубус (або вертикальний освітлювач, див. малюнок 1 і 2), розташований між трансфокатором мікроскопа та окулярними тубусами. На сьогоднішній день цей тип освітлення обмежений додатками, в яких застосовуються стереомікроскопи із загальним головним об'єктивом (CMO), оскільки для налаштування стереомікроскопа Грену або іншого стереомікроскопа, заснованого на схемі зведення променів, під світло флуоресценції неможливе використання деталей, що випускаються серійно.

Світло, випромінюване дуговою лампою, направляється через лінзу-колектор, що налаштовується, на збудливий фільтр, що знаходиться в комбінованому блоці світлофільтрів (як показано на малюнках 2 і 3). Цей фільтр пропускає світло лише у певному хвильовому діапазоні (смузі пропускання). Світло, що пройшло через фільтр, потім відхиляється оптичним шляхом мікроскопа в його нижню частину (модуль трансфокатора і об'єктив у стереомікроскопі) і направляється на зразок дихроічним дзеркалом, яке, залежно від налаштування, відображає, селективно-фільтрує і/або пропускає світло певних довжин хвиль/областей спектра. Термін дихроічне (або дихроматичне) відображає властивість фільтра або дзеркала «розрізняти» кольори падаючого світла, відображаючи світло того кольору, який виявляється нижче заданої межі довжин хвиль, і, пропускаючи кольори вище цієї межі.

Мал. 2. Хід променів у флуоресцентному стереомікроскопі

Сфокусований пучок світла збудження проходить через трансфокатор і об'єктив, де утворює перевернутий світловий конус, опромінюючий зразок, що викликає збудження всіх флуорофорів у зразку, смуга поглинання яких відповідає смузі пропускання опромінюючого світла. Вторинне флуоресцентне світіння (з довжиною хвилі зазвичай більшої збуджуючого світла), що випускається зі зразка, захоплюється загальним головним об'єктивом стереомікроскопа і прямує назад через трансфокатор до порогового фільтра, який блокує світло на довжині хвилі збудження і пропускає лише світло з довжиною хвилі. Тубус мікроскопа на малюнках 1 і 2 сконструйований таким чином, що більш довгі хвилі флуоресцентного випромінювання, проходячи назад, лівий і правий оптичні канали трансфокатора, фокусуються незалежно перед тим, як вони досягнуть епіфлуоресцентного освітлювача. Світло з лівого каналу проходить прямо до порогового фільтра, після якого прямує в окулярні тубуси або фотопорт. Навпаки, світло у правому каналі спочатку прямує назад через дихроічне дзеркало, а потім до порогового фільтра та очків. Це світло не має виходу до порту камери і може бути використане тільки для спостереження зразка.

Деталі конструкції комбінованого флуоресцентного блоку фільтрів представлені на малюнках 2 і 3. Кожен блок містить односмуговий фільтр світла збудження, два порогових фільтри і дихроічне дзеркало. Світло ртутної дугової лампи потрапляє у блок світлофільтрів через збуджуючий фільтр, і відбивається від поверхні дихроичного дзеркала, як говорилося вище, і як показано малюнку 3. Вторинне флуоресцентне випромінювання проходить через порогові фільтри. Збудливий фільтр, дихроічне дзеркало та пороговий фільтр лівого каналу вклеєні в систему, а пороговий фільтр правого каналу закріплений у невеликій рамці, яка може бути видалена з блоку, якщо послабити її гвинти. Знявши пороговий фільтр, можна отримати доступ до діхроїчного дзеркала, розташованого всередині блоку фільтрів. Під час встановлення змінних фільтрів слідкуйте за тим, щоб клей не потрапив на поверхню фільтрів, і перед тим, як брати фільтри та дихроїчне дзеркало, обов'язково надягайте рукавички, щоб не забруднити поверхню відбитками пальців.

Флуоресцентний вертикальний освітлювач може вмістити три блоки світлофільтрів та порожній блок діа-фільтрів (без фільтрів) для звичайного спостереження методом світлого поля. Блоки фільтрів кріпляться на напрямних та встановлюються в оптичний шлях за допомогою рукоятки, що використовується для контролю положення напрямних. До кожного блоку додається відповідна ідентифікаційна табличка-пластина. Таблички вставляють у щілинний отвір у корпусі освітлювача в послідовному порядку, щоб оператор міг легко вибрати потрібний блок фільтрів для флуоресцентного спостереження.

Мал. 3. Комбінації фільтрів флуоресценції у стереомікроскопі

Набір комбінацій фільтрів, представлений у таблиці 1. Ці фільтри охоплюють широкий діапазон флуоресцентного збудження та випромінювання та повинні бути корисними у багатьох біологічних дослідженнях, де застосовуються звичайні флуоресцентні барвники. Ці комбінації фільтрів також підходять для промислового використання, наприклад, для аналізу напівпровідникових пластин з ІС на забруднення флуоресцентними полімерами фоторезистів. За допомогою підбору відповідної комбінації фільтрів збудження/випускання можуть використовуватися флуоресцентні зонди з довжинами хвиль збудження в діапазоні від 380 до 510 нанометрів (див. таблицю 1). Ці комбінації фільтрів також дуже корисні в дослідженнях з різними мутантами зелених флуоресцентних білків, включаючи їх блакитний та синій різновид.

У культурах живих клітин з флуоресцентними мітками білків інтенсивність сигналу може бути значно підвищена, якщо комбінації фільтрів точно відповідають профілю збудження та випромінювання флуорофорів. Наприклад, у випадку DS-червоних сигналів, візуальне спостереження та реєстрація зображення червоної флуоресценції фотоприймачами можуть бути значно покращені за рахунок зміщення червоного сигналу у бік емісії помаранчевого світла. На додаток, комбінації фільтрів, підібрані для досліджень зразків рослин, з інтенсивною фоновою автофлуоресценцією хлорофілу, часто бувають ефективнішими при точному доборі відповідних специфікацій фільтру та емісійного сигналу. Багато цих критеріїв враховуються інженерами-розробниками мікроскопів для оптимізації смуги пропускання різних комбінацій фільтрів стереомікроскопів.

Табл. 1. Комбінації флуоресцентних фільтрів стереомікроскопів

Комплект фільтрів

Діапазон довжин хвиль збудження

Дихроїчне дзеркало

Діапазон довжин хвиль випромінювання

Синій GFP/DAPI

Блакитний (EGFP) GFP

Смуга пропускання GFP

Розширена смуга пропускання GFP

TRITC (Ds-червоний)

Смуга пропускання жовтого GFP

Як і всі чутливі інтерференційні фільтри, фільтри комбінованого блоку з часом виходять з ладу через інтенсивне світлове та ультрафіолетове опромінення. Такі характеристики, як смуга пропускання та коефіцієнт пропускання, також змінюються при використанні та зберіганні фільтрів у середовищі з підвищеною вологістю. Для збільшення терміну служби такі фільтри слід зберігати в сушильній шафі або герметично закритому контейнері з вологопоглиначем. Якщо спостереження не проводяться, затвор освітлювача слід тримати закритим, щоб зменшити кількість світла через фільтри. Чищення фільтра можна проводити тільки сухим повітрям з балончика, м'якою щіткою з верблюжої вовни або газом безмасляним з газового балона. Щоб уникнути подряпин та потертостей, ніколи не протирайте фільтри з м'яким інтерференційним покриттям фільтрів, тканиною для протирання лінз.

Фокусування та юстування дугових ламп

Придбайте практичний досвідюстирування та фокусування дугових ламп за допомогою цього навчального інтерактивного додатка Mercury or Xenon Burner, в якому змодельовано всі процеси юстування лампи у флуоресцентному мікроскопі.

За допомогою стереомікроскопів можна спостерігати різні зразки у світлі флуоресценції. Завдяки збільшенню об'єктива від 0,5 до 1,6 і діапазону трансфокації до 15, ці стереомікроскопи можуть забезпечити загальне збільшення системи від 4 до 540, що порівняно з діапазоном спостереження класичних складних мікроскопів. Широкий діапазон збільшення дозволяє мікроскопістам спостерігати як великі живі зразки, так і дрібні деталі тонких зрізів, пофарбованих флуорохромами, поміщених на предметному склі. Приклад спостереження у світлі флуоресценції з високим коефіцієнтом збільшення наведено малюнку 4. На ньому представлений пофарбований трьома мітками товстий зразок нирки миші. Зразок був пофарбований ДАПІ, Alexa Fluor 488 WGA та Alexa Fluor 568 (використовувалися зонди Alexa Fluor та зразок компанії Molecular Probes і спостерігався з використанням трьох комбінацій фільтрів з таблиці 1: Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed). можливості флуоресцентної стереомікроскопії на великих збільшеннях під час спостереження зразків, підготовлених для складних мікроскопів.

Мал. 4. Зріз нирки миші у світлі флуоресценції

Інші виробники стереомікроскопів пропонують альтернативні способи освітлення для флуоресцентного збудження та спостереження. У найбільш популярній конфігурації, представленій на малюнку 5, флуоресцентного збудження використовується зовнішня схема, що не використовує оптичну систему мікроскопа для візуалізації зображень. Світло з блоку освітлювача, спочатку проходить через фільтр, що збуджує, і потім направляючи через тубус, розташований ззаду корпусу мікроскопа. У нижній частині тубуса розташована система лінз, що спрямовують світло збудження на зразок. У такій конфігурації світло направляється прямо на зразок при будь-якому збільшенні трансфокатора, забезпечуючи тим самим однакову інтенсивність освітлення флуоресцентного і рівномірний темний фон при будь-якому значенні збільшення.

Вторинне флуоресцентне випромінювання, що випускається забарвленим зразком, захоплюється загальним головним об'єктивом (рисунок 5) і проходить каналами блоку трансфокатора до порогових фільтрів у верхній частині мікроскопа. Після цього світло прямує або до очків для прямого спостереження, або тубус камери для отримання цифрового зображенняабо мікрофотографування. У цій конфігурації не потрібні діхроїчні дзеркала, і це її головна перевага, інша перевага – незалежність від попередньо зібраних блоків фільтрів, що дає досліднику більшу свободу вибору фільтрів. Тим не менш, ця конфігурація може призвести до помилок у роботі недосвідчених операторів, спричинених неправильним підбором комбінації фільтрів.

Мал. 5. Мікроскоп з окремим ходом променів світла збудження

Інтенсивне ультрафіолетове випромінювання ртутної дугової лампи, яка використовується як джерело світла збудження у флуоресцентній мікроскопії, може завдати серйозних пошкоджень сітківки ока. Щоб уникнути цього, на корпусі мікроскопів багатьох виробників є захисні пристрої, які відфільтровують ультрафіолетове світло, що опромінює зразок на предметному столику. Інші запобіжні заходи включають ультрафіолетові порогові фільтри на шляху спостереження та захист від розсіяного світла навколо блоку освітлювача. У напрямні та поворотні рамки флуоресцентних інтерференційних фільтрів, якщо вони не використовуються, часто вставляються спеціальні заглушки у формі фільтрів.

Флуоресцентні стереомікроскопи часто обладнані спеціальною діафрагмою, розташованою десь між блоком ртутного освітлювача і вертикальним освітлювачем, для блокування небезпечного ультрафіолетового випромінювання, що походить від лампи, в той час, коли зразок не спостерігається. Коли спостереження не проводяться, цю діафрагму необхідно встановлювати по дорозі проходження світла.

При спостереженні зразків світлосильними апохроматичними об'єктивами (від 1.6x до 2.0x) у флуоресцентній стереомікроскопії, у нижніх ділянках поля зору можуть виникати відблиски або гарячі плями. Цей артефакт зазвичай проявляється тільки при низьких коефіцієнтах трансфокації, і зникає на великих збільшеннях. У більшості випадків відображення не виникають, якщо збільшення об'єктиву мало (від 0,5 до 1,0х), незалежно від оптичної корекції, і цей ефект зазвичай відсутній у об'єктивів з високою числовою апертурою і низькою корекцією (ахромати або планахромати).

Як показано у таблиці 2, у флуоресцентній мікроскопії існує багато додатків, де застосовуються стереомікроскопи. Кількість зразків, які зручно спостерігати саме в цьому режимі, дуже велика, і вони відносяться до широкого кола дисциплін від біології до промислових виробництв.

Табл. 2. Додатки флуоресцентної стереомікроскопії

Область

Програми - Аналіз

Біологія

Експресія генів, сортування клітин, диссекція, процеси розвитку, дослідження очей та м'язів

Ботаніка

Фармакологія

Капілярний потік, ліки, природоохоронні спостереження

Гідрологія

Якість води, клітинні структури та аналіз мембран фільтрів

Агрономія

Вивчення насіння, експресія генів та трансгенетика

Електроніка

Паяльна паста, аналіз епоксидних смол, перевірка покриттів, відбір полімерів для інтегральних мікросхем

Напівпровідники

Забруднення фоторезистами, наявність сторонніх частинок, виробничий контроль

Полімери

Наявність сторонніх частинок, пустот, гранул, неполімеризованих областей

Металообробка

Тріщини, поверхневі дефекти, забруднення, зварювання, аналіз руйнувань

Матеріали

Тріщини, зварювання, карбонові сполуки, дослідження орієнтацій

Паперове виробництво

Волокна, покриття та включення

Судова експертиза

Текстильні волокна, рідини організму, відбитки пальців, банкноти, підробки

Флуоресцентна стереомікроскопія має унікальну, порівняно з класичним складним мікроскопом, властивість тривимірного спостереження. На додаток до цього, стереомікроскопи мають великі робочі відстані та глибину поля, що забезпечує більш широке панорамне поле зору та більш інтенсивну флуоресценцію. Ці характеристики мають велике значення для дослідників, яким доводиться працювати з великими біологічними зразками та матеріалами, і для фахівців, які ведуть підготовчу роботу, як, наприклад, монтаж компонентів, виробничий контроль електроніки або різання. Оскільки для спеціальних додатків стають доступнішими все більш точні комбінації фільтрів, застосування флуоресценції у стереомікроскопії продовжує зростати.

Сучасний метод цитогенетичного аналізу, що дозволяє визначати якісні та кількісні зміни хромосом (у тому числі транслокації та мікроделеції) та використовуваний для диференціальної діагностики злоякісних захворювань крові та солідних пухлин.

Синоніми росіяни

Флуоресцентна гібридизація in situ

FISH-аналіз

Синоніми англійські

Fluorescence in-situ hybridization

Метод дослідження

Флуоресцентна гібридизація in situ.

Який биоматериал можна використовуватиме дослідження?

Зразок тканини, зразок тканини в парафіновий блок.

Як правильно підготуватись до дослідження?

Підготовка не потрібна.

Загальна інформація про дослідження

Флуоресцентна гібридизація in situ (FISH, від англ. fluorescence in- situ hybridization) – це один із самих сучасних методівдіагностики хромосомних аномалій Він ґрунтується на використанні ДНК-проб, мічених флуоресцентною міткою. ДНК-проби є спеціально синтезовані фрагменти ДНК, послідовність яких комплементарна послідовності ДНК досліджуваних аберантних хромосом. Таким чином, ДНК-проби розрізняються за складом: визначення різних хромосомних аномалій використовуються різні, специфічні ДНК-проби. ДНК-проби також різняться за розміром: одні можуть бути спрямовані до цілої хромосоми, інші до конкретного локусу.

В ході процесу гібридизації за наявності в досліджуваному зразку аберантних хромосом відбувається їх зв'язування з ДНК-пробою, яке при дослідженні за допомогою флуоресцентного мікроскопа визначається як флуоресцентний сигнал (позитивний результат тесту FISH). За відсутності аберантних хромосом незв'язані ДНК-проби в ході реакції "відмиваються", що при дослідженні за допомогою флуоресцентного мікроскопа визначається як відсутність флуоресцентного сигналу (негативний результат тесту FISH). Метод дозволяє оцінити як наявність флуоресцентного сигналу, а й його інтенсивність і локалізацію. Таким чином, FISH-тест – це не лише якісний, а й кількісний метод.

FISH-тест має низку переваг у порівнянні з іншими методами цитогенетики. В першу чергу дослідження FISH може бути застосоване як до метафазних, так і до інтерфазних ядрів, тобто до клітин, що не діляться. Це основна перевага FISH у порівнянні з класичними способами каріотипування (наприклад, фарбуванням хромосом по Романівському-Гімзі), які застосовуються лише до метафазних ядр. Завдяки цьому дослідження FISH є точнішим методом для визначення хромосомних аномалій у тканинах з низькою проліферативною активністю, у тому числі у солідних пухлинах.

Так як у FISH-тесті використовується стабільна ДНК інтерфазних ядер, для дослідження можуть бути використані різні біоматеріали - аспірати тонкокутної аспіраційної біопсії, мазки, аспірати кісткового мозку, біоптати і, що немаловажно, збережені фрагменти тканини, наприклад гістологічні блоки. Так, наприклад, FISH-тест може бути успішно виконаний на повторних препаратах, отриманих з гістологічного блоку біоптату молочної залози при підтвердженні діагнозу "аденокарцинома молочної залози" і необхідності визначення HER2/neu-статусу пухлини. Слід особливо наголосити, що в даний момент дослідження FISH рекомендовано як підтверджує тест при отриманні невизначеного результату імуногістохімічного дослідження пухлини на онкомаркер HER2/neu (ІГХ 2+).

Іншою перевагою FISH є його здатність визначати мікроделеції, які не виявляються за допомогою класичного каріотипування або ПЛР. Це має особливе значення при підозрі на синдром Ді Джорджі та велокардіофаціальний синдром.

FISH-тест широко використовується у диференціальній діагностиці злоякісних захворювань, насамперед у онкогематології. Хромосомні аномалії у поєднанні з клінічною картиною та даними імуногістохімічного дослідження є основою класифікації, визначення тактики лікування та прогнозу лімфо- та мієлопроліферативних захворювань. Класичними прикладамиє хронічний мієлолейкоз – t (9; 22), гострий промієлоцитарний лейкоз – t (15; 17), хронічний лімфолейкоз – трисомія 12 та інші. Що стосується солідних пухлин, найчастіше FISH-дослідження застосовується при діагностиці раку молочної залози, сечового міхура, товстої кишки, нейробластоми, ретинобластоми та інших.

Дослідження FISH також може бути використане у пренатальній та преімплантаційній діагностиці.

FISH-тест часто проводять у поєднанні з іншими методами молекулярної та цитогенетичної діагностики. Результат цього дослідження оцінюють у комплексі з результатами додаткових лабораторних та інструментальних даних.

Навіщо використовується дослідження?

  • Для диференціальної діагностики злоякісних захворювань (крові та солідних органів).

Коли призначається дослідження?

  • При підозрі на наявність злоякісного захворювання крові чи солідних пухлин, тактика лікування та прогноз яких залежить від хромосомного складу пухлинного клону.

Що означає результати?

Позитивний результат:

  • Наявність у досліджуваному зразку аберантних хромосом.

Негативний результат:

  • Відсутність у досліджуваному зразку аберантних хромосом.

Що може впливати на результат?

  • Кількість аберантних хромосом.

  • Імуногістохімічне дослідження клінічного матеріалу (з використанням 1 антитіла)
  • Імуногістохімічне дослідження клінічного матеріалу (з використанням 4 і більше антитіл)
  • Визначення HER2 статусу пухлини методом FISH
  • Визначення HER2 статусу пухлини методом СІSH

Хто призначає дослідження?

Онколог, педіатр, акушер-гінеколог, лікар-генетик.

Література

  • Wan TS, Ma ES. Молекулярні cytogenetics: an indispensable tool for cancer diagnosis. Anticancer Res. 2005 Jul-Aug; 25 (4): 2979-83.
  • Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Impact of cytogenetic and molecular cytogenetic studies on hematologic malignancies. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
  • Mühlmann M. Molecular cytogenetics в metaphase and interphase cells for cancer and genetic research, diagnosis and prognosis. Application in tissue sections and cell suspensions. Genet Mol Res. 2002 р. Jun 30;1(2):117-27.

У деяких випадках цитогенетичного дослідження буває недостатньо для видачі висновку про каріотип, у цих випадках використовують молекулярно-цитогенетичні методи, зокрема флуоресцентну гібридизацію in situ (англ. – Fluorescence In Situ Hybridization – FISH).

Поява нових технологій молекулярної цитогенетики, що базуються переважно на in situ гібридизації нуклеїнових кислот, значно розширила можливості хромосомної діагностики. Метод гібридизації in situ був розроблений для локалізації конкретних послідовностей ДНК безпосередньо на цитологічних препаратах. Відбувся перехід в ідентифікації хромосом та хромосомних районів з аналізу цитологічної організації хромосоми на аналіз послідовностей ДНК, що входять до їхнього складу. Сравнение эффективности классических цитологических методов выявления и анализа хромосомных перестроек, таких как дифференциальные окраски хромосом, с современными молекулярно-цитогенетическими технологиями показало, что при гематологических нарушениях цитологический анализ хромосом детектирует и правильно идентифицирует лишь около трети хромосомных перестроек, выявляемых при использовании спектрального кариотипирования (SKY) . Ще близько третини перебудов ідентифікуються цитологічними методами неправильно, а третина залишається зовсім непоміченою. Класичні методи цитогенетичного аналізу дозволяють виявляти лише близько 15% хромосомних перебудов, що ідентифікуються за допомогою SKY.

У методі FISH використовуються флуоресціюючі молекули для прижиттєвого забарвлення генів або хромосом. Метод використовується для картування генів та ідентифікації хромосомних аберацій.

Методика починається з приготування коротких послідовностей ДНК, які називаються зондами, які є комплементарними по відношенню до послідовностей ДНК, що представляють об'єкт вивчення. Зонди гібридизуються (зв'язуються) з комплементарними ділянками ДНК і завдяки тому, що вони позначені флуоресцентною міткою, дозволяють бачити локалізацію генів, що цікавлять, у складі ДНК або хромосом. На відміну від інших методів вивчення хромосом, що вимагають активного поділу клітини, FISH можна виконувати на клітинах, що не діляться, завдяки чому досягається гнучкість методу.

FISH може застосовуватися для різних цілей із використанням зондів трьох різних типів:

  • * Локус-специфічні зонди, що зв'язуються з певними ділянками хромосом. Дані зонди використовуються для ідентифікації наявної короткої послідовності виділеної ДНК, яка використовується для приготування міченого зонда та його подальшої гібридизації з набором хромосом;
  • альфоїдні або центромірні зонди-повтори є повторюваними послідовностями центромірних областей хромосом. З їхньою допомогою кожна хромосома може бути пофарбована в різний колір, що дозволяє швидко визначити число хромосом і відхилення від їх нормального числа;
  • зонди на всю хромосому є набором невеликих зондів, комплементарних до окремих ділянок хромосоми, але в цілому покривають її довжину. Використовуючи бібліотеку таких зондів, можна «розфарбувати» всю хромосому і отримати диференціальний спектральний каріотип індивіда. Даний тип аналізу застосовується для аналізу хромосомних аберацій, наприклад, транслокацій, коли шматочок однієї хромосоми переноситься на плече іншої.

Гібридизація in situ з флуоресцентною міткою (FISH)

Матеріалом дослідження є кров, кістковий мозок, біопсія пухлини, плацента, ембріональні тканини чи амніотична рідина. Зразки для дослідження повинні доставлятися до лабораторії у свіжому вигляді. Препарати (слайди) готуються безпосередньо із зразків тканини або після їхнього культивування. Можуть використовуватися як метафазні, і інтерфазні препарати клітин. Мічені флуоресцентними мітками специфічні ДНК-зонди гібридизуються з хромосомною ДНК, причому можна одночасно використовувати множинні зонди до різних локусів.

FISH є корисним та чутливим методом цитогенетичного аналізу при виявленні кількісних та якісних хромосомних аберацій, таких як делеції (у тому числі і мікроделеції), транслокації, подвоєння та анеуплоїдії. FISH на інтерфазних хромосомах служить швидким методом пренатальної діагностики трисомій по 21, 18 або 13 хромосом або аберацій статевих хромосом. В онкології за допомогою FISH можна виявляти ряд транслокацій (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), пов'язаних із гематологічними злоякісними новоутвореннями. Метод також може використовуватись для моніторингу залишкових явищонкозахворювання після хіміотерапії та пересадки кісткового мозку та виявлення посилених онкогенів (c-myc/n-myc), пов'язаних з несприятливим прогнозом щодо деяких пухлин. FISH також використовується для контролю приживання алотрансплантата кісткового мозку, отриманого від індивіда протилежної статі.

FISH є чутливим методом для ідентифікації хромосомних аберацій та одномоментного швидкого аналізу великого (>500) числа клітин. Метод має високу точність при ідентифікації природи хромосом та невідомих фрагментів хромосомної ДНК.