Метод хроматографії на паперівідноситься до площинної хроматографії, він заснований на розподілі аналізованих речовин між двома рідинами, що не змішуються.
У розподільчій хроматографії поділ речовин відбувається внаслідок відмінності коефіцієнтів розподілу компонентів між двома рідинами, що не змішуються. Речовина є в обох фазах у вигляді розчину. Нерухома фаза утримується у порах хроматографічного паперу, не взаємодіючи з нею, папір виконує функцію носія нерухомої фази.
Види хроматографічного паперу:
1) гідрофільний папір утримує в порах до 22% води; нерухома фаза – вода, рухлива – органічний розчинник; такий папір застосовується визначення водорозчинних речовин.
2) гідрофобний папір відштовхує воду, тому її просочують неполярним органічним розчинником (нерухома фаза); рухлива фаза – вода; такий папір застосовується для визначення нерозчинних у воді сполук (жиророзчинні кислоти, вітаміни).
До хроматографічного паперу пред'являються такі вимоги:
¨ хімічна чистота;
¨ хімічна та адсорбційна нейтральність по відношенню до аналізованих речовин та рухомої фази;
¨ однорідність за щільністю;
¨ однакова спрямованість волокон.
Для отримання хроматограми на папір наносять краплю суміші, що аналізується. Папір поміщають у хроматографічну камеру, її кінець занурюють у посудину з елюентом. Розчинник просувається по паперу, суміш аналізованих речовин розподіляється між рухомою та нерухомою фазами і поділяється на папері у вигляді плям або смуг. Положення зон компонентів визначають проявом хроматографічного паперу відповідними реагентами, які з компонентами суміші, що розділяється, утворюють забарвлені сполуки.
Для кількісної оцінки здатності поділу речовин у хроматографічній системі застосовують коефіцієнт розподілу К р - відношення концентрації речовини в нерухомій та рухомій фазах. Експериментальне встановлення коефіцієнтів розподілу в даному методі неможливе, для оцінки здатності поділу речовин на папері застосовують коефіцієнт зміщення (рухливості) Rf. Коефіцієнт усунення дорівнює відношенню швидкості руху речовини () до швидкості руху рухомої фази (). Експериментально величину R f знаходять як відношення відстані Х, пройденої речовиною, до відстані Х f , пройденої розчинником від старту до лінії фронту:
.
Коефіцієнт R f змінюється не більше 0 – 1,00. Величина R f залежить від природи визначається речовини, виду хроматографічного паперу, якості та природи розчинника, способу нанесення проби, техніки експерименту та температури. Коефіцієнт R f не залежить від концентрації речовини, що визначається, і присутності інших компонентів.
Ідентифікаціюпо хроматограмі виконують такими способами:
¨ візуальним порівнянням характерного фарбування зон речовин на досліджуваній та стандартній хроматограмах;
¨ виміром коефіцієнтів рухливості R f для стандартної та аналізованої речовини у певному розчиннику. Хроматографування та встановлення R f для досліджуваної та стандартної сумішей проводять на однаковому папері та в одній камері в строго ідентичних умовах. Зіставляючи коефіцієнти R f роблять висновок про присутність в аналізованої суміші тих чи інших компонентів.
кількісне визначеннявиконують безпосередньо за хроматограмою або при вимиванні (елююванні) аналізованої речовини з паперу.
Способи кількісного аналізу:
¨ візуальне порівняння інтенсивності забарвлення плям на досліджуваній та стандартній хроматограмах (напівкількісне визначення, точність 15 –20 %);
¨ вимір площі плями, утвореного даним компонентом, та знаходження концентрації речовини за градуювальним графіком, побудованим для серії стандартних розчинів у координатах: площа плями – концентрація речовини; точність визначення 5 - 10%;
¨ елюювання визначеної речовини з поверхні хроматограми та спектрофотометричний або флуориметричний вимір оптичної щільності елюату (А); концентрацію речовини в розчині розраховують за формулою:
де К – коефіцієнт пропорційності; S - площа плями, виміряна попередньо, мм 2; точність визначення 1%.
За способом хроматографування розрізняють висхідну (рис. 21), низхідну (рис. 22), кругову (рис. 23), градієнтну та двовимірну хроматографії.
Метод хроматографії на папері широко застосовується для визначення неорганічних сполук, амінокислот, амінів, білків, вуглеводів, жирних кислот, фенолів, вітамінів у хімічній, харчовій, фармацевтичній промисловості, медицині, біохімії
Метод знайшов застосування у аналізі практично всіх харчових продуктів: у цукровому виробництві – визначення вуглеводів; у хлібопекарському та кондитерському – амінокислот, органічних кислот, вуглеводів, полісахаридів та карбонільних сполук; у виноробстві – органічних кислот та амінокислот; у виробництві молока та молочних продуктів – амінокислот; у м'ясопереробній промисловості – фенолів, жирних та летких кислот, амінокислот та карбонільних сполук.
У потоці розчинника (елюенти). Хроматограмою у разі називають картину розташування хроматографич. зон на папері після завершення поділу. У паперовій хроматографії використовується гол. обр. спец. хроматографіч. папір, який повинен бути максимально однорідним і містити тільки целюлозні волокна. Вона може бути нерухомою фазою або інертним носієм нерухомої фази.
У розподільчій паперовій хроматографії нерухома фаза - адсорбована папером вода чи неполярні орг. розчинники, якими просочують папір (варіант зі зверненими фазами), а елюенти - соотв. суміші орг. розчинників з водою, що часто містять також к-ти, комплексоутворюючі та ін. в-ва, або водні розчининеорг. к-т та солей. Швидкість переміщення компонентів залежить від коеф. їх розподіл між фазами і від співвідношення обсягів цих фаз.
Насправді часто реалізуються одночасно дек. механізмів розподілу. Паперова хроматографія здійснюється в скляних хроматографіч. камерах або ін. закритих судинах. Для поліпшення відтворюваності часто кондиціонують, покриваючи внутр. стінки фільтрувальним папером, змоченим відповідним розчинником. У камеру поміщають лоток з елюентом, в який опускають край хроматографіч. папери після нанесення на неї проби поділяються в-в (звичайно об'ємом 1-10 мкл). Елюенти рухається під дією капілярних і гравітацій. сил. За розташуванням паперу і напрямку струму елюентів розрізняють висхідну, низхідну та горизонтальну паперову хроматографію. Хроматографування можна проводити також у відцентровому полі або в умовах градієнта, що збільшує ефективність і швидкість поділу. У т. зв. двовимірної паперової хроматографії пробу наносять в один з кутів квадратного листа і після завершення хроматографування в одному елюенті папір висушують і, повернувши на 90°, занурюють в ін. На двовимірній хроматограмі одержують до n 2 хроматографіч. зон, де і число зон, що утворюються при звичайній (одномірній) паперовій хроматографії .
Після підйому р-телегля на певну висоту папір виймають з камери, висушують і виявляють хроматографіч. зони. Якщо зони не пофарбовані, хроматограму обприскують розчинами специфічності. реагентів , що утворюють з компонентами суміші, що пофарбовані або флуоресцирующие сполуки. Використовують також ферментативні та біол. методи детектування, напр., виявлення ферментів хроматограму обробляють розчином відповідних субстратів . Радіоактивні речовини виявляють, експонуючи хроматограму на рентгенівську плівку.
Положення хроматографіч. зон у паперовій хроматографії характеризують величиною R f , що є відношенням шляху, пройденого центром хроматографіч. зони, до шляху, пройденому фронтом р-телі: R f = 1 /, де К s і V т - обсяги соотв. нерухомої та рухомий фаз, До d-коеф. розподілу в-ва між цими фазами. Похибка визначення R f бл. 5%. У стандартизованих умовах ця величина стала для кожного в-ва і використовується для його ідентифікації.
Кількості. аналіз проводять безпосередньо на хроматограмах або після відділення в-ва хроматографіч. зон від целюлозної основи У першому випадку компоненти визначають за допомогою скануючої денситометрії, флуориметрії, фотометрії або за розміром хроматографії. зон, а також активації. методами (при використанні останніх двох методів зони попередньо вирізують). Межі виявлення в-ву зонах по забарвленим похідним становлять 0,1-10 мкг, флуориметрично -10 -3 -10 -2 мкг, активаційним методом - 10 -4 -10 -10 мкг. Відділення компонентів від целюлозної основи здійснюють екстрагуванням, спалюванням паперу або кип'ятінням її в суміші до-т. Потім компоненти визначають будь-яким відповідним методом, зазвичай спектрофотометричним, титриметричним або кінетичним. Похибка кількостей. аналізу не перевищує 10%.
Для поділу компонентів суміші методом паперової хроматографії на смужку фільтрувального хроматографічного паперу в 2-4 см від кінця її поміщають краплю аналізованого зразка, а кінець смужки опускають у розчинник, який починає рухатися папером під дією капілярних сил. Для запобігання дегідратації паперу рухливу фазу зазвичай насичують водою. При русі рухомої фази компоненти досліджуваного зразка, нанесеного на папір поблизу старту, розподіляються між розчинником, що рухаються, і плівкою води, що утримується целюлозою. При цьому компоненти рухаються з різною швидкістю у вигляді зон, розмір яких зазвичай дещо більший за розмір початкової плями. Хроматографію на папері зазвичай проводять у закритій посудині (рис. 1), щоб уникнути випаровування розчинника при хроматографуванні. При висхідній хроматографії верхній кінець смужки паперу закріплюють у тримачі, а нижній опускають розчинник, який налитий в низьку кювету або чашку Петрі, розташовану на дні судини, в якому проводиться хроматографування. Для цього можна використовувати також великий мірний циліндр, на дно якого наливають рухливу фазу, а зверху закривають склом.
Рис. 1 - хроматографія на папері: А - висхідна хроматограма; Б - низхідна хроматограма; 1 - посудина для хроматографування; 2 – резервуар з розчинником; 3 - хроматографічний папір; 4 – стартові точки; 5 – розділені компоненти; 6 - фронт розчинника
При низхідній хроматографії розчинник рухається вниз папером з розташованої у верхній частині посудини резервуара з розчинником. У такий спосіб можна елюювати окремі компоненти.
Прояв паперових хроматограм у принципі не відрізняється від описаного для тонкошарових.
Ефективність паперової хроматографії залежить від типу паперу, і від складу рухомої фази. Сорти паперу відрізняються пористістю, товщиною, ступенем гідратації. За швидкістю руху розчинники розрізняють швидкі, середні та повільні папери. Найбільш поширені типи хроматографічних паперів - ленінградська, ватман та ін.
Найбільш поширені системи розчинників: СН3СООН-Н2O (15:85 об'єм), 1-бутанол - СН3СООН-Н20 (4:1:5), 2-пропанол - NH3 (конц.) - Н2O (9:1:2), 1 -бутанол – 1,5 н. NH3 (1:1), фенол - вода та ін. Склад рухомої фази зазвичай підбирають експериментально або орієнтуючись на дані, наведені в довідниках або монографіях паперової хроматографії.
Використання іонообмінного паперу дозволяє поєднувати переваги паперової хроматографії та іонного обміну. Такий папір одержують шляхом змішування іонообмінної смоли з целюлозою, яка використовується для виготовлення паперу.
Паперова хроматографія має велике значення для якісного аналізу. Використання її у кількісному аналізі обмежене.
Паперова хроматографія. З першого слова вам зрозуміло, що це пов'язане з папером; а друге слово "хроматографія" означає "колір" (хрому) і "писати" (графія). Складіть їх і ви отримаєте «писати кольором на папері» .
Паперова хроматографія є найважливішим тестом у науці. Ретельно проаналізувавши склад хімічної речовини за кольором, вчений може встановити вихідні речовини. Легко зрозуміти, що хроматографія, справді гідна вивчення, працює саме з допомогою капілярного ефекту – способу, яким вода поширюється папері.
Колонка містить хроматографічний сорбент, виконує функцію поділу суміші на індивідуальні компоненти. Елюенти - рухлива фаза: газ, рідина або (рідше) надкритичний флюїд. Нерухома фаза - тверда фаза або рідина, пов'язана на інертному носії, адсорбційної хроматографії - сорбент. Хроматограма - результат реєстрації залежності концентрації компонентів на виході з колонки від часу. Детектор - пристрій реєстрації концентрації компонентів суміші на виході з колонки. Хроматограф – прилад для проведення хроматографії.
Східна хроматографія Метод, при якому рухома фаза рухається вниз Східна хроматографія Метод, при якому рухома фаза рухається вгору Горизонтальна хроматографія Метод, при якому рухома фаза рухається горизонтально Кругова хроматографія Метод, при якому рухома фаза рухається з середини кола якому просування рухомої фази продовжується і після досягнення фронтом кінця паперу Повторна хроматографія Метод, при якому після першого просування рухомої фази хроматограму висушують і хроматографування повторюють (іноді кілька разів) Прояв Спосіб виявлення речовин на хроматограмі Носій Хроматографічний папір
Нерухома (стаціонарна) фаза Фаза, закріплена на носії Рухлива (мобільна) фаза Фаза, що забезпечує переміщення речовин, що розділяються по носієві з нерухомою фазою Старт Місце, на яке наноситься випробувана проба
У паперовій хроматографії використовують спеціальні сорти паперу, що розрізняються за номерами, із зростанням яких щільність паперу збільшується. Папір утримує у порах воду, яка і є нерухомою рідкою фазою. Розчин проби наносять у вигляді крапель на аркуш паперу певній відстані від краю. Після випаровування розчинника край листа поміщають у герметичну камеру, що містить проявник - рухливу рідку фазу (наприклад, спирти, кетони, феноли, чотирихлористий вуглець, хлороформ та інші суміші, а також суміші з неорганічними розчинниками). При цьому відбувається пересування вихідної плями струму проявника і поділ суміші на компоненти. Якщо речовини не пофарбовані, то хроматограму виявляють, наприклад, обприскуванням розчином індикатора, розглядають в ультрафіолетових променях та ін. постійною величиною; Rf для різних речовин відрізняються за значенням та можуть бути використані для ідентифікації сполук.
Класифікація Паперову хроматографію, як і хроматографію взагалі, можна розділити розподільчу адсорбційну Нормальний (метод застосовується для поділу ліпофільних речовин.)
Кількісні визначення різних речовин у плямах хроматограми провадяться звичайними аналітичними методами. Розрізняють: одномірні, двовимірні, кругові, колонкові та електрофоретичні хроматограми.
I. Адсорбційна хроматографія заснована на вибірковій адсорбції окремих компонентів аналізованої суміші відповідними адсорбентами. Працюючи цим методом аналізований розчин пропускають через колонку, заповнену дрібними зернами адсорбенту. Застосовують адсорбційну хроматографію для поділу неелектролітів, парів та газів. ІІ. Розподільна хроматографія заснована на використанні відмінності коефіцієнтів сорбируемости окремих компонентів аналізованої суміші між двома рідинами, що не змішуються. Одна з рідин (нерухома) знаходиться в порах пористої речовини (носія), а друга (рухлива) являє собою інший розчинник, який не змішується з першим.
Цей розчинник пропускають через колонку із невеликою швидкістю. Різні величини коефіцієнтів розподілу забезпечують неоднакову швидкість руху та поділу компонентів суміші. Коефіцієнт розподілу речовини між двома розчинниками, що не змішуються, є відношення концентрації речовини в рухомому розчиннику до концентрації тієї ж речовини в нерухомому розчиннику: (К = Сподв/Снеподв).
Іноді як носій для нерухомого розчинника замість колонки використовують смужки або листи фільтрувального паперу, що не містить мінеральних домішок. У цьому випадку краплю випробуваного розчину наносять на край смужки паперу, яку підвішують у закритій камері, опустивши її край з нанесеною на неї краплею випробуваного розчину в посудину рухомим розчинником (рушієм), який, переміщаючись папером, змочує її. При цьому кожна речовина, що міститься в аналізованій суміші, переміщається з властивою йому швидкістю в тому ж напрямку, що і рушій.
Особливим виглядомрозподільчою хроматографією є газорідинна хроматографія (ГЖК). Як нерухому фазу використовують різні нелеткі рідини, нанесені на інертний твердий носій; в якості рухомої фази газоподібні азот, водень, гелій, двоокис вуглецю та ін. або сталеві та скляні капіляри діаметром 0, 2 0, 3 мм та довжиною 25 100 м з рідкою фазою, нанесеною на стінки цих капілярів (капілярна газорідинна хроматографія).
. Іонообмінна хроматографія заснована на використанні іонообмінних процесів, що протікають між рухомими іонами адсорбенту та іонами електроліту при пропусканні розчину аналізованої речовини через колонку, заповнену іонообмінною речовиною (іонітом). Іоніти являють собою нерозчинні неорганічні та органічні високомолекулярні сполуки, що містять активні (іоногенні) групи. Рухомі іони цих груп здатні при контакті з розчинами електролітів обмінюватися на катіони або аніони розчиненої речовини. Як іоніти застосовують окис алюмінію (для хроматографії), пермутин, сульфовугілля та різноманітні іонообмінні речовини іонообмінні смоли. Іоніти ділять на катіоніти, здатні до катіонного обміну (містять активні групи: SO 3 H, COOH, OH); аніоніти, здатні до аніонного обміну (активні групи: NH 2 = NH); амфоліти – іонообмінні речовини, що мають амфотерні властивості.
IV. Осадова хроматографія заснована на різній розчинності опадів, що утворюються різними компонентами аналізованої суміші зі спеціальними реактивами, нанесеними на високодисперсну речовину. Аналізовані розчини пропускають через колонку, заповнену пористою речовиною (носієм). Носій просочений реактивом осадником, який утворює з іонами розчину осади, що мають різну розчинність. Осади, що утворилися, в залежності від розчинності розташовуються в певній послідовності по висоті колонки.
V. Ексклюзивна (молекулярно ситова) хроматографія заснована на різній проникності молекул компонентів у нерухому фазу (високопористий неіоногенний гель). Ексклюзивна хроматографія поділяється на гельпроникну (ГПХ), в якій елюенти - неводний розчинник, і гель фільтрацію, де елюенти - вода.
Вносячи в центр листка змоченого фільтрувального паперу краплю суміші червоних і синіх чорнил і акуратно наносячи по краплях чисту воду, ви скоро отримаєте таку ж картинку. Внизу - кільцева хроматограма на папері складної суміші шести різних амінокислот,
виявлена чотирма різними реактивами. Вгорі справа-двовимірна хроматограма ще більш складної суміші чотирнадцяти різних амінокислот. Ця хроматограма отримана з однієї краплі розчину суміші кислот, нанесеної в точку, позначену кружальцем. Прояв вевся почергово у двох напрямках різними реактивами. Кожна мітка пляма належить до однієї амінокислоти. За фарбування та положення плями можна точно встановити природу речовини. Вгорі зліва - хроматограма звичайної чорнильної плями плями на промокальному папері.
Прояв хроматограм Прояв компонентів на хроматограмі проводять одним із способів, наведених нижче. Фізичні методи (Візуально, при денному світлі, відзначають на хроматограмі положення плям кольорових речовин. За наявності флуоресціюючих речовин прояв проводять в УФ світлі.) Хімічні методи Рідкі проявники наносять пульверизатором або використовують реагенти в аерозольній упаковці, газоподібні застосовують, помістивши хроматограму в пари проявника.
Хроматограму кладуть горизонтально на лист фільтрувального паперу або залишають підвішеною на скляній паличці і обприскують якомога дрібнішими краплями (туманом) проявника всю площу хроматограми спочатку з одного, а потім з іншого боку. При прояві газоподібним проявником хроматограму підвішують в камері, в яку поміщений летючий реагент (наприклад, кристали йоду), або на дні якої одержують хімічним шляхом (наприклад, оксиди азоту отримують шляхом додавання твердого нітриту натрію до розчину соляної кислоти).
Біологічні методи Хроматограми виявляють, використовуючи біологічну активність речовин, що хроматографуються. Якісна оцінка хроматограми полягає у визначенні положення плями або смуги, яке характеризується значенням R f = a/b де a відстань від центру плями проби до стартової лінії, мм; b відстань від фронту розчинника до стартової лінії, мм, або значенням Rx: Rx= a/c, де відстань від центру плями речовини порівняння до стартової лінії, мм.
Визначення кількості шуканого компонента в пробі проводять шляхом порівняння розмірів та інтенсивності забарвлення його плями з плямами речовини порівняння, нанесеними на папір в інтервалі значень концентрації, зазначених у нормативно-технічній документації на випробуваний реактив, та обробленими в умовах випробування. Оцінку проводять візуально або за допомогою апаратури (наприклад, денситометра, пристрої для сканування плям компонентів на папері) або шляхом елюювання плям і наступного фотометричного визначення оптичної щільності розчинів. Хроматограми зберігають в умовах, що перешкоджають появі взаємних відбитків хроматограм (наприклад з прокладками з фільтрувального паперу). Якщо характер плям дозволяє, то хроматограми наносять шар швидкосохнучого лаку. У разі потреби проводять замальовку контуру хроматограми або фотографування.
ПРИКЛАДИ ОБЛАДНАННЯ ДЛЯ ПАПЕРОВОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ ТА СПОСОБІВ ЙОГО ВИКОРИСТАННЯ Камера для висхідної та низхідної хроматографії 1. Камера для висхідної та низхідної хроматографії (Рис 1) Чорт. 2. Камера для горизонтальної хроматографії (рис2) (рис2)1 камера; 2 грати зі скляних паличок; 3 скляна паличка для притискання кінця хроматограми; 4 кришка; 5 хроматограма; 6 розчинник
Чорт. 3. Камера для кругової хроматограми (дві чашки Петрі) (Рис 3) 1 паперовий гніт; 2, 4 чашки Петрі; 3 кругова хроматограма; 5 розчинник Чорт. 4. Способи розташування хроматограми при висхідній хроматографії (рис 4) 1 хроматограма; 2 хроматографічна камера; 3 розчинник
Чорт. 5. Спосіб вкладання паперової хроматограми в жолобок 1 хроматограма; 2 старт; 3 скляна паличка; 4 загнута паличка для притискання хроматограми у жолобку; 5 жолобок
Двовимірну хроматограму одержують поділом плям одновимірної хроматограми іншим проявником у напрямку, перпендикулярному першому ряду плям. На круговій хроматограмі пляма, розміщена в центрі листа, розмивають по концентричних кіл. У колонковій паперовій хроматографії поділ проводять на паперових дисках, щільно вставлених у циліндричну колонку. Для отримання електрофоретичних хроматограм паперовий лист просочують електролітом, закріплюють між електродами, наносять аналізовану суміш, підключають електроди до джерела постійного струмуі одночасно на папір подають рухомий розчинник у напрямку, перпендикулярному до напряму силових лінійелектричний струм.
У цьому методі поділ компонентів відбувається внаслідок їх неоднакового розподілу між двома рідкими фазами та різної швидкостіпереміщення речовин під дією електричного поля. Паперову хроматографію використовують для поділу та аналізу неорганічних та органічних речовин у природних та промислових матеріалах (наприклад, визначають смоли у нафтопродуктах, рідкісноземельні елементи у гірських породах та мінералах).
Хроматографічні методи незамінні у контролі якості харчових продуктів. Харчову цінністьпродуктів визначають, аналізуючи амінокислотний склад білків, ізомерний склад жирних кислот і гліцеридів у жирах, вуглеводи, органічні кислоти та вітаміни. У Останніми рокамибагато з цих аналізів виконуються за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Для оцінки безпеки продуктів у них виявляють харчові добавки (консерванти, антиоксиданти, речовини, що підсолоджують, барвники та ін.), визначають свіжість продуктів, встановлюють ранні стадіїпсування та допустимі терміни зберігання.
У харчових продуктах методами хроматографії можна виявити такі забруднюючі речовини, як пестициди, нітрозаміни, мікотоксини (афлатоксини, охратоксин А, зеараленон та ін), поліядерні ароматичні сполуки, біогенні аміни, нітрати та ін. Забруднення харчових продуктів можливе і внаслідок матеріалів упаковки, зокрема, хлористого вінілу, бензолу, пластифікаторів та ін. м'ясних продуктахвизначають анаболітичні стероїди, гормони та інші типи фармацевтичних препаратів, зловживання якими характерне для інтенсивного тваринництва. Окрема сфера застосування газової хроматографії - аналіз складу аромату харчових продуктів. Виявлено тисячі летких компонентів, з яких лише кілька десятків визначають характер запаху, інші надають запаху та смаку продукту індивідуальності.
Останніми роками виник новий напрямок енантіоселективного аналізу компонентів їжі. За співвідношенням оптичних ізомерівамінокислот, оксикислот та деяких інших сполук можна однозначно встановити, чи цей продукт є натуральним чи містить синтетичні імітатори та добавки. Енантіомерний аналіз показав, що мікрохвильова обробка харчових продуктів, на відміну від термічної жорсткої, не призводить до рацемізації амінокислот. Однак усі молочні продукти, піддані процесам бродіння, містять чимало (нетоксичних) D аланіну та D аспарагінової кислоти продуктів життєдіяльності молочнокислих бактерій.
У природних жирах переважають ціс ізомери жирних кислот. Нещодавно виявлено, що транс ізомери підвищують вміст ліпопротеїнів низької щільності та зменшують концентрацію ліпопротеїнів високої щільності в крові, що може сприяти розвитку атеросклерозу. Розробка методики газохроматографічного поділу та аналізу всіх ізомерів жирних кислот змусила виробників у кілька разів знизити вміст трансізомерів. ненасичених кислоту маргарині.
p align="justify"> Методом газової хроматографії в деяких сирах виявлено багато небажаних фізіологічно активних біогенних амінів, і ці сорти сиру були заборонені. У Японії в харчових продуктах використовується L-триптофан, отриманий за допомогою генної інженерії та біотехнології. І коли у тисяч людей виявили невідоме раніше захворювання та десятки хворих померли, хроматографічними методами було встановлено, що ці трагічні наслідки викликані наявністю токсичних забруднень у триптофані (виявлено 60 домішок). Газохроматографічному аналізу піддаються вина, коньяки та інша спиртовмісна продукція.
Тепер знову повернемось до фальшивого вершковому маслу. Є така олія – «Селянське». На вигляд - олія як олія. Пахне як вершкове. Смачне. Для початку вирішено було перевірити, скільки в ньому тригліцеридів. У цьому маслі тригліцеридів від маси всіх ліпідів - більшість. У середньому – 98%. Для перевірки застосовуємо метод тонкошарової хроматографії. Використовуємо платівки Sorbfil. Хроматографічна система найпростіша – бензол.
Розподільна хроматографія заснована на властивості розділяються компонентів по-різному розподілятися між двома рідкими фазами, що не змішуються або слабозмішуються. Одна з рідких фаз є нерухомою фазою, вона міцно утримується на поверхні твердої речовини - носія - у вигляді мономолекулярного шару рідини. В іншій фазі - рухомий - розчиняють досліджувану суміш, нанесену на носій.
У процесі хроматографування відбувається перерозподіл речовин суміші між двома рідкими фазами, що не змішуються. Швидкість пересування окремих компонентів різна, що зумовлює можливість виділення їх із складної суміші. У практиці досліджень найпоширеніший метод розподільчої хроматографії на папері.
Розподільча хроматографія на папері.Носителем служить повітряносухий фільтрувальний папір, а гігроскопічна вода, що міститься в ній, є нерухомою фазою. В якості рухомої фази застосовують органічні розчинники, що не змішуються або частково змішуються з водою.
При отриманні хроматограм за методом паперової хроматографії на край смуги фільтрувального паперу наносять краплю досліджуваного розчину, потім смугу занурюють спеціально призначену для хроматографування скляну ванну, що містить рухомий розчинник. При просуванні розчинника по паперу окремі компоненти суміші також переміщуються, але з різною швидкістю, що забезпечує розподіл суміші.
Хроматограми одержують у герметичних камерах в атмосфері, насиченій парами органічного розчинника та води. Отримані хроматограми висушують і для прояву розділених речовин обприскують (проявляють) реактивом, який утворює забарвлені сполуки з виділеними речовинами, що дозволяє визначити їх розташування на смузі паперу. У певних умовах досвіду розподіл окремих речовин обох рідких фазах характеризується постійним коефіцієнтом Rf.
Коефіцієнт розподілу Rf визначається відношенням відстані (в см), пройденого випробуваним розчином, до відстані (см), пройденому розчинником. Відтворюваність значень Rf залежить від умов досліджень (якості паперу, ступеня чистоти розчинників, температури, складу газової атмосфери і т.д.).
Розрізняють кілька варіантів паперової хроматографії: висхідна – розчинник рухається знизу вгору, низхідна – розчинник рухається зверху вниз і радіальна (кругова) – розчинник рухається від центру до кола. Крім того, застосовують одновимірну та двовимірну хроматографію; при одновимірній хроматографії поділ речовин проводять в одному напрямку, при двомірній - у двох взаємно перпендикулярних напрямках.
Одновимірна хроматографія.Одномірна хроматографія найбільш проста і застосовується для дослідження нескладних сумішей, перевірки чистоти речовини, для ідентифікації речовин.
При одновимірній хроматографії методика визначення полягає у наступному. На смугу хроматографічного паперу з відривом кількох сантиметрів від краю наносять певну кількість досліджуваного розчину. Папір поміщають у ванну з розчинником, що знаходиться в камері, використовуючи методику висхідної або низхідної хроматографії (рис. 11). Розчинник при цьому просувається і коли до кінця залишається приблизно 2 см, процес припиняють, хроматограму виймають з камери, відзначають фронт розчинника і висушують при температурі 100° для видалення розчинника.
Хроматограму виявляють обробкою спеціальним реактивом і за розташуванням кольорових плям, що утворилися, на хроматограмі встановлюють Rf для певної речовини, враховуючи відстань від вихідної точки нанесення розчину до середини відповідної плями. Потім за спеціальними таблицями можна визначити, якій речовині (наприклад, якій амінокислоті) відповідає пляма. Зазвичай для ідентифікації речовин використовують одночасно отриману хроматограму відомих речовин - свідків. За збігом розташування цих хроматограм встановлюють ідентичність речовин.
Двовимірна хроматографія.Двовимірну хроматографію застосовують для поділу складних сумішей, наприклад, для характеристики амінокислот, одержуваних при гідролізі білків. Цей хроматографічний метод полягає в тому, що поділ речовин проводять у два прийоми двома розчинниками у взаємно перпендикулярних напрямках.
Радіальна (кругова) хроматографія.Для радіальної хроматографії застосовують круглі фільтри, які ділять простим олівцем на ряд однакових за розміром секторів і проводять два кола - одне на відстані 1 - 1,5 см від центру і друге на відстані 5 см. На лінію першого кола (стартової) у кожному секторі наносять краплі досліджуваного розчину, а друге коло є межею хроматограми. У центрі паперового диска роблять отвір, вставляють паперовий гніт, який занурюють у розчинник.
Піднімаючись паперовим гнотом, розчинник переходить на паперовий диск і, поширюючись по паперу, переносить компоненти, що знаходяться в краплі, від центру до кола. Як камери застосовують чашки Петрі з високими бортами. Радіальна хроматографія є найпростішим і найшвидшим методом хроматографічного поділу речовин. У цьому методі досягається високий ефект поділу.
При кількісному аналізі методом паперової хроматографії папір наносять певний обсяг досліджуваного розчину. Якщо аналізують розчини з невеликою концентрацією досліджуваних речовин, краплі наносять кілька разів, щоразу підсушуючи нанесену пляму, потім проводять хроматографічне поділ.
Для кількісного визначеннявиділених речовин користуються наступним прийомом. З отриманої хроматограми вирізують ділянку, що містить виділену речовину, елююють її розчинником і визначають концентрацію за допомогою спектрофотометра або фотоелектроколориметра.