5 / 5 ( Голосів: 1 )
Сьогодні досить часто можна виявити неякісні ліки та таблетки-пустушки, які викликають у споживача сумніви щодо їхньої ефективності. Існують певні методи аналізу лікарських засобів, що дозволяють з максимальною точністю визначити склад ліків, його характеристики, а це дозволить виявити ступінь впливу лікарського засобу на організм людини. Якщо у вас є певні скарги на лікарський препарат, тоді його хімічна експертиза та об'єктивний висновок можуть бути доказом у будь-якому судовому розгляді.
Які методи аналізу лікарських засобів використовують у лабораторіях?
Для встановлення якісних та кількісних характеристик ліків у спеціалізованих лабораторіях широко застосовують такі методи:
- Фізичні та фізико-хімічні, які допомагають визначити температуру плавлення та затвердіння, щільність, склад та чистоту домішок, знайти вміст важких металів.
- Хімічні, що визначають наявність летких речовин, води, азоту, розчинність лікарської речовини, її кислотне, йодне число тощо.
- Біологічні, що дозволяють випробувати речовину на стерильність, мікробну чистоту, вміст токсинів.
Методи аналізу лікарських засобів дозволять встановити справжність заявленого виробником складу та визначать найменші відхилення від норм та технології виробництва. У лабораторії АНО "Центр хімічних експертиз" є все необхідне обладнання для точного дослідження будь-якого виду ліків. Висококваліфіковані фахівці застосовують різноманітні методи аналізу лікарських засобів та у найкоротші терміни нададуть об'єктивний висновок експертизи.
У сучасному фармацевтичному аналізі почали широко застосовуватися неводні розчинники. Якщо раніше основним розчинником в аналізі була вода, то тепер одночасно застосовують і різноманітні неводні розчинники (крижану або безводну оцтову кислоту, оцтовий ангідрид, диметил-формамід, діоксан та ін), що дозволяють змінювати силу основи і кислотності аналізованих речовин. Отримав розвиток мікрометод, зокрема крапельний метод аналізу, зручний для використання у внутрішньоаптечному контролі якості ліків.
Широкий розвиток у Останніми рокамиотримують такі методи дослідження, при яких використовують поєднання різних методів при аналізі лікарських речовин. Наприклад, хромато-мас-спектрометрія - це поєднання хроматографії та мас-спектрометрії. У сучасний фармацевтичний аналіз дедалі більше проникає фізика, квантова хімія, математика.
Аналіз будь-якої лікарської речовини або сировини необхідно починати із зовнішнього огляду, звертаючи при цьому увагу на колір, запах, форму кристалів, тару, упаковку, колір скла. Після зовнішнього огляду об'єкта аналізу беруть середню пробу для аналізу відповідно до вимог ГФ X (с. 853).
Методи дослідження лікарських речовин поділяються на фізичні, хімічні, фізико-хімічні, біологічні.
Фізичні методи аналізу передбачають вивчення фізичних властивостей речовини, не вдаючись до хімічних реакцій. До них відносяться: визначення розчинності, прозорості
- або ступеня каламутності, кольоровості; визначення щільності (для рідких речовин), вологості, температури плавлення, затвердіння, кипіння. Відповідні методики описані у ГФ X.(с. 756-776).
Хімічні методидослідження ґрунтуються на хімічних реакціях. До них відносяться: визначення зольності, реакції середовища (рН), характерних числових показників олій та жирів (кислотне число, йодне число, число омилення тощо).
Для цілей ідентифікації лікарських речовин використовують тільки такі реакції, які супроводжуються наочним зовнішнім ефектом, наприклад зміною забарвлення розчину, виділенням газів, випаданням або розчиненням опадів і т. п.
До хімічних методів дослідження відносяться також вагові та об'ємні методи кількісного аналізу, прийняті в аналітичної хімії(Метод нейтралізації, осадження, редокс-методи та ін). В останні роки в фармацевтичний аналіз увійшли такі хімічні методи дослідження, як титрування в неводних середовищах, комплексометрія.
Якісний і кількісний аналіз органічних лікарських речовин, як правило, проводять за характером функціональних груп в їх молекулах.
За допомогою фізико-хімічних методів вивчають фізичні явища, що відбуваються в результаті хімічних реакцій. Наприклад, у колориметричному методі вимірюють інтенсивність забарвлення в залежності від концентрації речовини, в кондуктометричному аналізі - вимірювання електропровідності розчинів і т. д.
До фізико-хімічних методів відносяться: оптичні (реф-рактометрія, поляриметрія, емісійний та флюоресцентний методи аналізу, фотометрія, що включає фотоколориметрію та спектрофотометрію, нефелометрія, турбодиметрія), електро-хімічні (потенціометричний та полярографічний методи).
Уніфікація методів кількісного визначення лікарських засобів
Кількісне визначення – це завершальний етап фармацевтичного аналізу. Вибір оптимального методу кількісного визначення залежить від можливості оцінити лікарський засіб фармакологічно активної частини молекули. Практично це зробити складно, тому зазвичай кількісне визначення препарату проводять за однією його хімічною властивістю, пов'язаною з наявністю тієї чи іншої функціональної групи, атома, катіону або аніону, а в ряді випадків за кількістю пов'язаної з органічною основою мінеральної кислоти. Наприклад:папаверину гідрохлорид можна кількісно визначити за пов'язаною хлористоводневою кислотою, але це допускається лише за експрес-аналізу в умовах аптеки.
Існує значна різниця в аналізі субстанцій лікарських речовин та їх лікарських форм. Умови застосування методів кількісного аналізу в лікарських формах залежить від складу лікарської суміші та фізико-хімічних властивостей усіх інгредієнтів, що входять до неї. При аналізі багатокомпонентних лікарських сумішей використовують два підходи: кількісне визначення без попереднього поділу інгредієнтів та з їх поділом. При виборі способів кількісного визначення без розподілу інгредієнтів необхідно переконатися, що супутні інгредієнти не впливають на результати аналізу.
Класифікація методів кількісного визначення лікарських речовин
|
Фізичні |
Хімічні |
Фізико-хімічні |
Біологічні |
|
1. Визначення густини. 2. Температури кипіння. |
1. Гравіметрія. 2. Титриметричні методи: Осаджувальне титрування; Кислотно-основне; Окисно-відновне титрування; Комплексонометрія; Нітритометрія. 3. Елементний аналіз. 4. Газометричні методи. |
1. Абсорбційні методи. 2. Оптичні методи. 3. Методи, засновані на випромінюванні випромінювання. 4. Методи, що ґрунтуються на використанні магнітного поля. 5. Електрохімічні 6. Методи поділу. 7. Термічні методи. |
1. Випробування токсичність. 2. Випробування на пірогенність. 4. Мікробіологічна чистота. |
Фізичні методи
Ці методи використовують для кількісного визначення, наприкладетилового спирту. ФС рекомендує встановлювати вміст етилового спирту за щільністю, або за температурою кипіння водно-спиртових розчинів (у тому числі настоянок) за методиками ОФС ГФ.
Хімічні методи
1. Ваговий метод (гравіметрія)
Метод заснований на тому, що з досліджуваної речовини, взятої у вигляді точної навішування на аналітичних вагах або певному обсязі, відміряному за допомогою бюретки або піпетки, виділяють за допомогою хімічних реакцій складову частину у вигляді осаду. Цей осад відфільтровують та зважують. Для розрахунку кількісного вмісту речовини у препараті використовують формулу. Метод відрізняється високою точністю, але трудомісткий.
Гравіметрично кількісно визначають солі хініну, які під дією розчину лугу утворюють осад основи хініну; алкалоїди, обложені у вигляді пікратів; натрієві солі барбітуратів, що при дії кислоти утворюють опади кислотних форм; деякі вітаміни, що утворюють нерозчинні у воді продукти гідролізу.
2. Титриметричні (об'ємні) методи
Відрізняються значно меншою трудомісткістю, ніж гравіметричний метод, та досить високою точністю.
Осаджувальне титрування
Метод ґрунтується на використанні реакцій осадження або утворення малодисоційованих сполук.
Аргентометрія
Метод ґрунтується на реакціях осадження галогенідів розчином нітрату срібла.
KCI + AgNO 3 → AgCI ↓ + KNO 3 Е = М.м.
Пряме титрування: Метод Мору: середовище нейтральне, індикатор - хромат калію, визначають Cl - і Br -. Метод Фаянсу:середовище оцтовокисле, індикатор - флуоресцеїн (Cl -) та еозинат натрію (I - , Br -).
Зворотне титрування(роданометрія, тіоціанометрія): Метод Фольгарду:середовище азотнокисле, індикатор - залізоамонієві галун, титранти - AgNO 3 і NH 4 CNS, у точці еквівалентності з'являється червоне забарвлення. Непрямий метод Фольгарду:спочатку після додавання 0,1 мл 0,1 М розчину NH 4 CNS з'являється червоне фарбування від взаємодії з індикатором, а потім титрують розчином AgNO 3 до знебарвлення.
Аргентометрично визначають галогеніди лужних металів, четвертинних амонієвих основ, солі галогеноводородних кислот органічних основ, сульфамідів.
Наприклад: сульфаніламіди утворюють солі срібла у вигляді білого осаду.
Аргентометричний метод відрізняється високою чутливістю, правильністю та відтворюваністю, простий у виконанні. Проте значна витрата дорогого срібла вимагає його заміни.
Меркуріметрія
Метод заснований на утворенні слабодисоційованих сполук ртуті (II).
Точку еквівалентності встановлюють потенціометрично або за допомогою індикаторів - дифенілкарбазиду або дифенілкарбазону, які утворюють з надлишком іонів ртуті (II), пофарбовані в червоно-фіолетовий колір сполуки.
Під час аналізу йодидів можливий безіндикаторний метод.
2KI + Hg(NO 3) 2 → HgI 2 ↓ + 2KNO 3 (червоний осад)
HgI 2 + 2 KI → K 2 HgI 4 (безбарвний)
K 2 HgI 4 + Hg(NO 3) 2 → 2HgI 2 ↓ + 2KNO 3 (червоний осад)
Е = 2 М.м. Титрують до стійкої червоної каламуті.
Кислотно-основне титрування (метод нейтралізації)
Це методи кількісного визначення лікарських речовин, що володіють кислотними та основними властивостями у водному чи неводному середовищі.
Розчинні у воді речовини, що мають кислі властивості, титрують сильними основами (алкаліметрія), а речовини основного характеру – розчинами сильних кислот (ацидиметрія). Найчастіше використовують при титруванні індикатори: метиловий помаранчевий, метиловий червоний, бромтимоловий синій, фенолфталеїн, тимолфталеїн.
|
Ацидиметрія |
Алкаліметрія |
|
Пряме титрування Титрують хлористоводневою кислотою натрієві солі неорганічних кислот. Наприклад: NaHCO 3 + HCl → NaCl + CO 2 + H 2 O |
Пряме титрування Титрують неорганічні кислоти, речовини гетероциклічної структури, що містять у молекулі групу COOH. Наприклад: HCl + NaOH → NaCl + H 2 O |
|
Зворотне титрування (Поєднання з гідролізом) Лікарські речовини, що являють собою складні ефіри або аміди, попередньо гідролізують розчином лугу, надлишок якого потім відтитрують кислотою. + 2NaOH → СН 3 СООNa + Н 2 О NaOH + HCl → NaCl + H 2 O |
Зворотне титрування (Поєднання з гідролізом) Гідроліз складних ефірів або амідів зазвичай виконують титрованим розчином кислоти, а надлишок її відтитрують лугом (наприклад, уротропін). Паралельно проводять контрольний досвід. |
|
Непряме визначення Алкалоїди теоброміну та теофіліну беруть в облогу іонами срібла, при цьому виділяється еквівалентна кількість азотної кислоти, яку відтитрують лугом. N-H + AgNO 3 → N-Ag ↓ + HNO 3 HNO 3 + NaOH → NaNO 3 + H 2 O |
|
|
Титрування у змішаних розчинниках |
|
|
Іноді органічну основу витягують хлороформом або ефіром, розчинник відганяють і титрують основу ацидиметричним методом. N − + HCI → N − . HCI |
Змішані розчинники складаються з води та органічних розчинників. Їх застосовують, коли препарат погано розчинний у воді або водні розчини мають слабовиражені кислотні або лужні властивості. Наприклад: саліцилова кислота розчиняється у спирті та титрується водним розчином NaOH. Деякі лікарські речовини при розчиненні змішаних розчинниках змінюють кислотно-основні властивості. Наприклад:борна кислота при розчиненні в суміші води та гліцерину підсилює кислотні властивостівнаслідок утворення одноосновної дигліцериноборної кислоти. Змішані розчинники(спирт + вода або ацетон + вода) використовують для алкаліметричного титрування сульфаніламідів. Розчинники, що не змішуються.(вода + хлороформ) використовують при кількісному визначенні солей органічних основ (наприклад, алкалоїди, новокаїн). Хлороформ витягує з водної фази органічну основу, що виділяється при титруванні лугом. N − . HCI + NaOH → N − ↓ + NaCI + Н 2 О |
|
Оксимний метод Заснований на нейтралізації еквівалентної кількості хлористоводневої кислоти, що виділилася в результаті взаємодії гідроксиламіну гідрохлориду з кетопохідними (наприклад, камфорою): С=O+NH 2 OH·HCl → C=N-OH↓ + HCl +H 2 O HCl + NaOH → NaCl + H 2 O |
|
|
Титрування серед неводних розчинників (неводне титрування) |
|
|
Зворотне титрування (поєднання з етерифікацією) Деякі спирти і феноли, наприклад, (гліцерин, синестрол), ацетилюють у неводному середовищі оцтовим ангідридом. Потім надлишок оцтового ангідриду, нагріваючи з водою, перетворюють на оцтову кислоту, яку титрують лугом. 2R-OH + (CH 3 CO) 2 O → 2R-O - C -CH 3 + H 2 O (CH 3 CO) 2 O хат. + H 2 O → 2CH 3 COOH 2CH 3 COOH +2NaOH→ 2CH 3 COONa+2 Н 2 О Паралельно проводять контрольний досвід. |
|
|
Органічні основи та їх солі ( наприклад: кофеїн, фтивазид) виявляють слабкі основні властивості, тому титрування виконують, використовуючи як розчинник безводну оцтову кислоту або оцтовий ангідрид. Титрант – розчин хлорної кислоти у безводній оцтовій кислоті. Індикатор – кристалічний фіолетовий у безводній оцтовій кислоті. Слабка органічна основа при роз- творінні в безводній оцтовій кислоті стає сильнішою основою: R 3 N + CH 3 COOH → R 3 N + − H + CH 3 COO - При приготуванні титранту утворюються перхлорат-іон та іон ацетонію: CH 3 COOH + HClO 4 → ClO 4 - + CH 3 COOH 2 + При титруванні: CH 3 COO - + CH 3 COOH 2 + → 2 CH 3 COOH, а R 3 N + − H + ClO 4 - → [ R 3 N + − H ] ClO 4 - Галогеніди четвертинних амонієвих основ і солі галогеноводородних кислот не можна точно відтитрувати в неводному середовищі, оскільки галоген-іони виявляють кислі властивості навіть серед безводної оцтової кислоти. Тому їх титрують у присутності (CH 3 COO) 2 Hg (можна взяти суміш мурашиної кислоти з оцтовим ангідридом 1:20), при цьому галогеніони зв'язуються в малодисоційовані сполуки. Приклади: димедрол, дибазол, промедол, ефедрину гідрохлорид. |
Органічні речовини, що виявляють слабкі кислі властивості ( наприклад:феноли, барбітурати, сульфаніламіди) титрують, використовуючи як розчинник ДМФ. Титрант – розчин NaOH у CH 3 OH або розчин метилату натрію. Індикатор – тимоловий синій. R−OH + H−C−N−CH 3 → R−O - + H−C−N−CH 3 R−O - + CH 3 ONa → R−ONa + CH 3 O – CH 3 O - + H−C−N−CH 3 → CH 3 OH + H−C−N−CH 3 Недоліком неводного титрування є необхідність герметизованої установки титрування. Робота ведеться з дуже токсичними летючими розчинниками. |
Окисно-відновне титрування
Методи засновані на використанні окисних та відновлювальних властивостей аналізованих речовин та, відповідно, титрантів.
Перманганатометрія
Метод заснований на використанні окисних властивостей титранту – перманганату калію в сильнокислому середовищі. При прямому титруваннііндикатором служить сам титрант, надлишок якого надає розчину рожевого забарвлення.
Цим методом титрують відновлене залізо, перекис водню.
2 КМnО 4 + 5 Н 2 О 2 + 3 Н 2 SО 4 → 2 МnSО 4 + К 2 SО 4 + 8 Н 2 О + 5 О 2
При зворотному титруваннінадлишок титранту встановлюють йодометрично. Кількісно визначають оберненим титруванням натрію нітрит.
5 NaNO 2 + 2 KMnO 4 + 3 H 2 SO 4 → 5 NaNO 3 + 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 3 H 2 O
2 KMnO 4 + 10 KI + 8 H 2 SO 4 → 2 MnSO 4 + 5 I 2 + 6 K 2 SO 4 + 8 H 2 O
Індикатор – крохмаль.
Йодометрія
Метод заснований на використанні окисних властивостей вільного йоду та відновлювальних властивостях йодид-іонів: I 2 + 2ē ↔ 2I -
Цим методом визначають лікарські речовини, здатні окислитися або відновлюється, а також здатні утворювати з йодом продукти заміщення. Йодометрично можна визначати надлишок титранта у зворотному перманганатометричному, йодхлорметричному, йодатометричному, броматометричному методах.
Пряме титруванняйодом застосовують визначення натрію тіосульфату.
2 Na 2 S 2 O 3 + I 2 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI
Індикатор – крохмаль.
Назадйодометричне визначення засноване на окисленні альдегідів йодом у лужному середовищі: I 2 + 2 NaOH → NaOI + NaI + H 2 O
R-C-H + NaOI + NaOH → R-C-ONa + NaI+H 2 O
Потім додають надлишок сірчаної кислоти, непрореагував гіпойодид перетворюється на йод, який відтитрують тіосульфатом натрію:
NaOI + NaI + Н 2 SО 4 → I 2 + Na 2 SO 4 + H 2 O
I 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI
Індикатором служить крохмаль, що утворює з йодом з'єднання, забарвлене синім кольором.
У лужному середовищі йодом окислюють фурацилін, окиснення ізоніазиду ведуть у розчині гідрокарбонату натрію. В основі йодометричного визначення метіоніну та анальгіну лежить реакція окислення сірки. Пеніциліни окислюють йодом після кислотного гідролізу.
Для кількісного визначення використовують поєднання реакцій заміщення або осадження з йодометрією. За допомогою титрованого розчину йоду одержують йодопохідні фенолів, первинних ароматичних амінів, антипірину, а також опади полійодидів алкалоїдів складу ∙ HI ∙ I 4 . Отримані опади відфільтровують, а надлишок йоду у фільтраті титрують натрію тіосульфатом.
Відновлювальні властивості калію йодиду використовують при титруванні заступника.
Лікарська речовина, що виявляє властивість окислювача, виділяє еквівалентну кількість вільного йоду при взаємодії з йодидом калію. Вільний йод, що виділився, відтитрують тіосульфатом натрію. Цим методом кількісно визначають перекис водню, калію перманганат, хлорне вапно, хлорамін, пантоцид.
Н 2 О 2 + 2 КІ + Н 2 SО 4 → I 2 + К 2 SО 4 + 2 Н 2 О
I 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI
Індикатор – крохмаль.
Йодхлорметрія
Це метод аналогічний до йодометрії. Але як титрант використовують розчин йодмонохлориду, який більш стійкий. Йодхлорметричним методом способом зворотного титруваннявизначають феноли та первинні ароматичні аміни. Аналізована речовина осаджується у вигляді йодпохідного, надлишок титранту встановлюють йодометрично:
ICI + KI → I 2 + KCI
Йодатометрія
Цим методом кількісно визначають, наприклад, аскорбінову кислоту. Лікарська речовина окислюється титрованим розчином йодату калію. Надлишок титранту встановлюють йодометрично, індикатор – крохмаль.
КІО 3 + 5 КІ + 6 HCI → 3 I 2 + 6 KCI + 3 H 2 O
I 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI
Броматометрія
Як титрант використовують бромат калію, що виявляє в кислому середовищі окислювальні властивості. Визначення зазвичай ведуть у присутності броміду.
КBrO 3 + 5 КBr + 6 HCI → 3 Br 2 + 6 KCI + 3 H 2 O
Виділився вільний бром витрачається або на окислення (гідразини та гідразиди), або на бромування (феноли та первинні ароматичні аміни) лікарської речовини. Індикаторами при прямому титруванніслужать барвники - азосполуки: метиловий червоний, метиловий помаранчевий - які окислюються і знебарвлюються під дією надлишку титранту в точці еквівалентності.
При зворотній броматометріїкінець титрування встановлюють йодометрично:
Br 2 + 2 KI → I 2 + 2 KBr
I 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI
Дихроматометрія
Метод заснований на осадженні деяких солей органічних основ титрованим розчином дихромату калію: 2 Cl - + K 2 Cr 2 O 7 → 2 Cr 2 O 7 + 2 KCl
Нерозчинні дихромати основ відфільтровують, а надлишок титранта визначають йодометрично: K 2 Cr 2 O 7 + 6 KI + 7 H 2 SO 4 → Cr 2 (SO 4) 3 + 3
I 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI
Визначають цим методом метиленовий синій та акрихін.
Цериметрія
Метод заснований на використанні стійкого титранту сульфату церію (IV), який у кислому середовищі відновлюється до сульфату церію (III): Ce 4+ + ē → Ce 3+
Прямим титруваннямвизначають сполуки заліза (II):
2 FeSO 4 + 2 Ce(SO 4) 2 → Fe 2 (SO 4) 3 + Ce 2 (SO 4) 3
При цьому використовують індикатори - дифеніламін або профенантролін (фероїн).
При зворотному титруваннінадлишок титранта визначають йодометрично:
2 Ce(SO 4) 2 + 2 KI → I 2 + Ce 2 (SO 4) 3 + K 2 SO 4
I 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → Na 2 S 4 O 6 + 2NaI
Комплексонометрія
Метод заснований на утворенні міцних, розчинних у воді комплексів катіонів металів з титрованим розчином трилону Б - динатрієвої сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти. Взаємодія відбувається у стехіометричному співвідношенні 1:1 незалежно від заряду катіону:
CH 2 COONa CH 2 COONa
CH 2 − N CH 2 − N
CH 2 COOH CH 2 COO
CH 2 COOH + MgSO 4 → CH 2 COO Mg + Н 2 SO 4
CH 2 − N CH 2 − N
CH 2 COONa CH 2 COONa
CH 2 COONa CH 2 COO
CH 2 − N CH 2 − N
CH 2 COOH CH 2 COO
CH 2 COOH + Bi 2 (SO 4) 3 → CH 2 COO Bi + Н 2 SO 4 + Na 2 SO 4
CH 2 − N CH 2 − N
CH 2 COONa CH 2 COO - Е = М/2.
При комплексонометричному титруванні дотримуються певного інтервалу значень pH, який досягається за допомогою буферних розчинів.
Індикатори, що застосовуються, називаються металоіндикаторами: КХТС (кислотний хром темно-синій), КХНС (кислотний хром чорний спеціальний), пірокатехіновий фіолетовий, ксиленоловий помаранчевий, кальконкарбонова кислота, мурексид. Перед досягненням точки еквівалентності вільні іони металу, що містяться в розчині, що титрується, зв'яжуться з титрантом. Останні порції титранта руйнують комплекс іона металу з індикатором, при цьому відбувається утворення комплексу металу з трилоном Б та вивільнення
вільних іонів індикатора, тому титрований розчин набуває фарбування вільного індикатора.
При прямому титруваннідо аналізованого розчину солей кальцію, магнію, цинку, вісмуту додають необхідний обсяг буферного розчину для досягнення потрібного значення рН та вказану в приватній статті кількість металоіндикатора. Потім титрують розчином трилону Б доти, поки в еквівалентній точці не відбудеться зміна забарвлення індикатора.
Зворотне титруваннязастосовують, якщо немає відповідного індикатора для прямого титрування, якщо реакція металу з трилоном Б йде повільно і якщо відбувається гідроліз металу при утворенні комплексонату.
При аналізі солей ртуті або свинцю надлишок трилону Б, який не вступив у взаємодію з аналізованим катіоном, відтитрують, використовуючи як титрант розчини солей цинку або магнію. Титрують також у присутності металоіндикатора та при певному значенні рН середовища.
Метод витіснення(або титрування за заступником) застосовують коли не можна підібрати відповідний індикатор, наприклад, при аналізі солей свинцю. Спочатку відому навішування солі магнію відтитрують трилоном Б в середовищі аміачного буфера в присутності металоіндикатора. Потім, після зміни забарвлення рідини, що титрується, додають навішення аналізованої солі свинцю. При цьому іони свинцю, утворюючи міцніший комплекс з трилоном Б, витісняє еквівалентну кількість іонів магнію. Далі проводять кількісне визначення вмісту витіснених іонів магнію.
Нітритометрія
Метод заснований на реакціях взаємодії первинних та вторинних ароматичних амінів з нітритом натрію в кислому середовищі, у присутності каталізатора броміду калію та при зниженій температурі.
Первинні ароматичні аміни (новокаїн, сульфаніламіди) утворюють з титрантом діазосполуки: Ar-NH 2 + NaNO 2 + HCl → Cl - + NaCl + 2H 2 O
Вторинні ароматичні аміни (дикаїн) у тих же умовах утворюють N-нітророз'єднання: Ar-NH-R + NaNO 2 + HCl→ Ar-N – R + NaCl + H 2 O
Точку еквівалентності встановлюють за допомогою зовнішніх індикаторів (йодкрохмальний папір), внутрішніх індикаторів (тропеолін 00, нейтральний червоний) або потенціометрично.
3. Елементний аналіз
Використовують для кількісного визначення сполук, що містять азот, галогени, сірку, вісмут та ртуть.
Метод К'єльдаля
Це фармакопейний метод визначення азоту в органічних сполуках, що містять амінний, амідний та гетероциклічний азот. Він ґрунтується на поєднанні мінералізації органічної речовини з подальшим застосуванням кислотно-основного титрування. Спочатку здійснюють мінералізацію зразка, нагріваючи з концентрованою сірчаною кислотою в колбі К'єльдаля. Потім отриманий гідросульфат амонію обробляють лугом і відганяють аміак, що виділився, в приймач з борною кислотою. В результаті утворюється метаборат та тетраборат амонію, які титрують 0,1 М HCl. Паралельно виконують контрольний досвід підвищення точності аналізу.
Для речовин, що містять амідну групу, що легко гідролізується в лужному середовищі, використовують непрямий методКьєльдаля. Це спрощений варіант, у якому виключена стадія мінералізації. Препарат руйнують лугом у колбі К'єльдаля і відганяють аміак, що виділився (або діалкиламін) в приймач. Метод трудомісткий.
Метод спалювання у колбі з киснем
Метод заснований на руйнуванні органічної речовини, що містить галогени, сірку, фосфор, спаленням у колбі, наповненій киснем у поглинаючій рідині та подальшому визначенні елементів, що знаходяться в розчині у вигляді іонів або молекул. Якісне та кількісне визначення виконують різними хімічними або фізико-хімічними методами. Перевага методу у швидкості мінералізації, у винятку втрат елемента у процесі мінералізації, високої чутливості аналізу.
Для аналізу галогеновмісних органічних речовин застосовують також і інші методи мінералізації (відновну, окислювальну та ін.).
Газометричний аналіз
Визначають кисень та циклопропан. Метод застосовується обмежено.
Фізико-хімічні методи аналізу
Ці методи відрізняються експресністю, вибірковістю, високою чутливістю, можливістю уніфікації та автоматизації, об'єктивністю оцінки якості препарату з фармакологічно активної частини молекули. Фізико-хімічні методи використовують для випробувань справжності, доброякісності та кількісного визначення лікарських речовин.
Оптичніметоди засновані на визначенні показника заломлення променя світла в випробуваному розчині (рефрактометрія), вимірюванні інтерференції світла (інтерферомет-
рію), здатності розчину речовини обертати площину поляризованого променя (поляриметрія). Методи відрізняються мінімальною витратою аналізованої речовини.
АбсорбційніМетоди засновані на властивості речовин поглинати світло в різних областях спектру. Наприклад, СПФ - в УФ-спектрі, ФЕК - у видимій області спектру,
ІЧ-спектроскопія – в ІЧ-спектрі.
До методів, заснованих на випромінюванні випромінювання, відносяться фотометрія полум'я (вимірюють інтенсивність випромінювання спектральних ліній випробуваних елементів), флуориметрія (заснована на здатності речовин флуоресціювати в УФ-світлі) та радіохімічні методи (засновані на вимірі β - або γ - Випромінювання).
Методи, засновані на використанні магнітного поля,являють собою ЯМР-і ПМР-спектроскопію, а також мас-спектрометрію.
До електрохімічнимметодам відносяться потенціометрія, заснована на вимірі рівноважних потенціалів, що виникають на межі між випробуваним розчином та зануреним у нього електродом; полярографія, заснована на вимірюванні сили струму, що виникає на мікроелектроді при електровідновленні або електроокисленні аналізованої речовини в розчині; кулонометрія, заснована на вимірюванні кількості електрики, витраченої на електрохімічне відновлення або окислення іонів, що визначаються.
До методам поділувідносять хроматографію, засновану на поділі речовин за рахунок розподілу їх між рухомою та нерухомою фазами; електрофорез, що ґрунтується на здатності заряджених частинок до переміщення в електричному полі; екстракцію з твердої речовини або з розчину екстрагентом, що не змішується з вихідною фазою і легко відокремлюється від неї і від речовини, що екстрагується.
Термічні методи аналізузасновані на точній реєстрації рівноважного стану між кристалічною та рідкою фазами аналізованої речовини.
Біологічні методи аналізу
Біологічну оцінку якості лікарських препаратів(Антибіотиків, серцевих глікозидів, гормонів) проводять за силою фармакологічного ефекту або за токсичністю. Проводять біологічні випробування на тваринах, окремих ізольованих органах, окремих групах клітин, і навіть певних штамів мікроорганізмів. Активність препаратів виражають у ОД (одиниці дії). До біологічних випробувань відносять визначення пірогенності на кроликах, токсичності на мишах, визначення вмісту гістаміноподібних речовин на кішках.
Визначення Курсова робота >> Медицина, здоров'я
... Методиконтролю вихідної сировини D. Методианалізу проміжних продуктів. е. Методианалізу готового лікарського засоби...Ніфантьєв, О.Є. Абревіатури, терміни та визначенняу сфері обігу лікарських коштів: Словник-довідник / О.Є. Ніфантьєв, ...
Одне з найважливіших завдань фармацевтичної хімії- це розробка та вдосконалення методів оцінки якості лікарських засобів.
Для встановлення чистоти лікарських речовин використовують різні фізичні, фізико-хімічні, хімічні методи аналізу чи їх поєднання.
ГФ пропонує такі методи контролю якості ЛЗ.
Фізичні та фізико-хімічні методи. До них відносяться: визначення температур плавлення та затвердіння, а також температурних меж перегонки; визначення густини, показників заломлення (рефрактометрія), оптичного обертання (поляриметрія); спектрофотометрія – ультрафіолетова, інфрачервона; фотоколориметрія, емісійна та атомно-абсорбційна спектрометрія, флуориметрія, спектроскопія ядерного магнітного резонансу, мас-спектрометрія; хроматографія – адсорбційна, розподільна, іонообмінна, газова, високоефективна рідинна; електрофорез (фронтальний, зональний, капілярний); електрометричні методи (потенціометричне визначення pH, потенціометричне титрування, амперометричне титрування, вольтамперометрія).
Крім того, можливе застосування методів, альтернативних фармакопейним, які іноді мають досконаліші аналітичні характеристики (швидкість, точність аналізу, автоматизація). У деяких випадках фармацевтичне підприємство набуває приладу, в основі використання якого лежить метод, ще не включений до Фармакопеї (наприклад, метод раманівської спектроскопії – оптичний дихроїзм). Іноді доцільно щодо автентичності чи випробуванні на чистоту замінити хроматографічну методику на спектрофотометрическую. Фармакопейний метод визначення домішок важких металів осадженням їх у вигляді сульфідів або тіоацетамідів має ряд недоліків. Для визначення домішок важких металів багато виробників впроваджують такі фізико-хімічні методи аналізу, як атомно-абсорбційна спектрометрія та атомно-емісійна спектрометрія з індуктивно пов'язаною плазмою.
Важливою фізичною константою, що характеризує справжність та ступінь чистоти ЛЗ, є температура плавлення. Чиста речовина має чітку температуру плавлення, яка змінюється у присутності домішок. Для лікарських речовин, що містять кілька допустимих домішок, ГФ регламентує інтервал температури плавлення в межах 2 °С. Але відповідно до закону Рауля (АТ = iK3C, де АТ - зниження температури кристалізації; К3 - кріоскопічна стала; С - концентрація) при і = 1 (неелектроліт) значення А Г не може бути однаковим для всіх речовин. Це пов'язано не тільки із вмістом домішок, а й з природою самого ЛХ, тобто з величиною кріоскопічної постійної К3, що відображає молярне зниження температури плавлення ЛХ. Таким чином, за однакового АТ = = 2 °С для камфори (К3 = 40) і фенолу (К3 = 7,3) масові часткидомішок не рівні і становлять відповідно 0,76 та 2,5 %.
Для речовин, які плавляться з розкладанням, зазвичай вказується температура, коли він речовина розкладається і відбувається різке зміна його виду.
У окремих приватних статтях ГФ X рекомендується визначати температуру затвердіння чи температуру кипіння (по ГФ XI - «температурні межі перегонки») ряду рідких ЛЗ. Температура кипіння має укладатися в інтервал, наведений у приватній статті.
Ширший інтервал свідчить про присутність домішок.
Багато приватних статтях ГФ X наведено допустимі значення щільності, рідше в'язкості, що підтверджують справжність і доброякісність ЛЗ.
Практично всі окремі статті ГФ X нормують такий показник якості ЛЗ, як розчинність у різних розчинниках. Присутність домішок ЛВ може вплинути на його розчинність, знижуючи або підвищуючи її залежно від природи домішки.
Критеріями чистоти є також колір ЛХ та/або прозорість рідких лікарських форм.
Певним критерієм чистоти ЛЗ можуть бути такі фізичні константи, як показник заломлення променя світла в розчині випробуваної речовини (рефрактометрія) і питоме обертання, обумовлене здатністю ряду речовин або їх розчинів обертати площину поляризації при проходженні через них плоскополяризованого світла (поляриметрія). Методи визначення цих констант відносяться до оптичних методів аналізу та застосовуються також для встановлення справжності та кількісного аналізу ЛЗ та їх лікарських форм.
Важливим критерієм доброякісності цілого ряду ЛЗ є вміст у них води. Зміна цього показника (особливо при зберіганні) може змінити концентрацію діючої речовини, а, отже, фармакологічну активність і зробити ЛЗ не придатним до застосування.
Хімічні способи. До них відносяться: якісні реакції на справжність, розчинність, визначення летких речовин і води, визначення вмісту азоту в органічних сполуках, титриметричні методи (кислотно-основне титрування, титрування в неводних розчинниках, комплексометрія), нітритометрія, кислотне число, число омилення, ефірне число, йодне число та ін.
Біологічні методи Біологічні методи контролю якості ЛЗ дуже різноманітні. У тому числі випробування на токсичність, стерильність, мікробіологічну чистоту.
Для проведення фізико-хімічного аналізу напівпродуктів, субстанцій лікарських засобів та готових лікарських форм при перевірці їх якості на відповідність вимогам ФС контрольно-аналітична лабораторія має бути оснащена наступним мінімальним набором обладнання та приладів:
ІЧ-спектрофотометр (для визначення справжності);
спектрофотометр для спектрометрії у видимій та УФ-області (визначення справжності, кількісне визначення, однорідність дозування, розчинність);
обладнання для тонкошарової хроматографії (ТСХ) (визначення справжності, споріднених домішок);
хроматограф для високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) (визначення справжності, кількісне визначення, визначення споріднених домішок, однорідності дозування, розчинності);
газорідинний хроматограф (ГРХ) (зміст домішок, визначення однорідності дозування);
поляриметр (визначення справжності, кількісне визначення);
потенціометр (вимір pH, кількісне визначення);
атомно-абсорбційний спектрофотометр (елементний аналіз важких металів та неметалів);
титратор К. Фішера (визначення вмісту води);
дериватограф (визначення втрати маси під час висушування).
УДК 615.015:615.07:53
АНАЛІЗ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ ПРИ ФАРМАКОКІНЕТИЧНИХ
ДОСЛІДЖЕННЯХ
Дмитро Володимирович Рейхарт1, Віктор Володимирович Чистяков2
Кафедра організації та управління у сфері обігу лікарських засобів (зав. – чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабрієв) Московської державної медичної академії ім. І.М. Сєченова,
2 Центр з хімії лікарських засобів - ВНІХФД (ген. директор - К.В. Шилін), м. Москва
Проведено огляд чутливих та специфічних аналітичних методів, що застосовуються щодо фармакокінетики лікарських препаратів. Показано переваги та обмеження застосування імуноферментного аналізу, методу високоефективної рідинної хроматографії з флуоресцентною та мас-спектрометричною детекцією. Застосування того чи іншого методу в оцінці фармакокінетики лікарських засобів у кожному даному випадку визначається структурою досліджуваного з'єднання і оснащеністю лабораторії.
Ключові слова: рідинна хроматографія, флюоресцентна та мас-спектрометрична детекція, імуноферментний аналіз, фармакокінетика.
Вивчення фармакокінетики ґрунтується головним чином на оцінці концентрації в організмі пацієнта лікарської речовини (ЛВ) у певні моменти часу після прийому препарату. Об'єктом дослідження служать кров (цілісна, сироватка, плазма), сеча, слина, кал, жовч, амніотична рідина та ін. Найбільш доступні і частіше досліджуються зразки крові та сечі.
Вимірювання концентрації ЛВ можна розділити на два етапи: 1 - виділення конкретної лікарської речовини з біологічного об'єкта, концентрування досліджуваної сполуки, відокремлення її від основних ендогенних компонентів; 2 - поділ суміші сполук, ідентифікація ЛХ та кількісний аналіз.
Вивчення концентрації препарату в крові дає інформацію про тривалість циркуляції ліків в організмі, біодоступність препарату, вплив концентрації на фармакологічний ефект, терапевтичну та летальну дози, динаміку утворення активних або токсичних метаболітів.
Вивчення концентрації препарату у сечі дозволяє оцінити швидкість елімінації ЛХ та функцію нирок. Концентрація метаболітів у сечі – непрямий показник активності метаболізуючих ферментів.
Дослідження біологічного матеріалу включає вимірювання маси (об'єму) проби, вивільнення препарату (метаболітів) з 532
клітин проби, відділення цілих клітин (наприклад, при аналізі крові) або частин клітин (при аналізі гомогенатів тканин), додавання внутрішнього стандарту, відділення білків, очищення проби (центрифугування, фільтрація), процедури екстракції, реекстракції, концентрування та перетворення досліджуваних речовин у зручні для аналізу похідні, основні процедури обробки проб крові та сечі відповідно (рис. 1).
«Ідеальний» аналітичний метод вимірювання концентрації ЛВ повинен володіти високою чутливістю, специфічністю та відтворюваністю, можливістю роботи з малими обсягами, простотою підготовки матеріалу, дешевизною та легкістю обслуговування обладнання, надійністю та можливістю автоматизації, простотою роботи персоналу та універсальністю (можливість аналізу різних класів ЛВ) .
Для отримання достовірних даних необхідно робити поправку на стабільність діючої речовини та/або продукту (продуктів), а також ступінь її біотрансформації в біологічних середовищах, що аналізуються.
Валідація методу повинна проводитись з урахуванням його передбачуваного застосування, при калібруванні слід враховувати діапазон концентрацій досліджуваного зразка. Категорично не рекомендується застосовувати два або більше методи аналізу проб в тому самому матеріалі зі подібним діапазоном калібрувальних значень.
Існує велика кількість методів визначення концентрації ЛХ у біологічних рідинах: xроматографічні, мікробіологічні, спектрофотометричні, полярографічні, імунологічні (радіоімунні, імуноензимні), радіоізотопні та інші методи.
Критичними параметрами методу є чутливість, швидкість, точність, можливість роботи з малим обсягом біоматеріалу та вартість.
У табл. 1 порівнюються аналітичні методи аналізу ЛХ.
Найбільш широко (до 95% досліджень) на практиці застосовується метод високоефектив-
Рис. 1. Основні процедури обробки проб крові та сечі.
ної рідинної хроматографії (ВЕРХ) з різними видами детекції.
Перевагами ВЕРХ у порівнянні, наприклад, з методом газорідинної хроматографії (ГЖХ) є відсутність обмежень щодо термостабільності аналізованих препаратів, можливість роботи з водними розчинами та летючими сполуками, використання варіантів «нормальнофазної» та «наверненофазної» хроматографії. Багато видів детекції є неруйнівними.
імуноферментний, ВЕРХ із флуоресцентною детекцією, ВЕРХ із мас-спектрометричною детекцією, які нині активно застосовуються у фармакокінетичних дослідженнях.
Імуноферментний метод
Метод імуноферментного аналізу (ІФА) запропоновано на початку 70-х років минулого сторіччя. Принцип ІФА полягає у взаємодії специфічних білкових ан-
Порівняльна характеристика методів аналізу лікарських засобів
Методи Абсолютна чутливість, г Чутливість, бали Складність, бали Виборчість, бали Універсальність Сумарна оцінка, бали
Рідина хроматографія:
УФ-детектор 10-7 3 -3 4 4 8
флуоресцентний детектор 10-8 - 10-9 4 -3 5 2 8
мас-спектрометричний детектор 10-11 - 10-12 5 -5 5 4 9
Імунологічні 10-10 - 10-11 5 -1 4 1 9
Газова хроматографія:
електронозахоплювальний детектор 10-10 5 -4 4 2 7
полум'яно-іонізаційний детектор 10-8 - 10-9 4 -3 2 4 7
ми; методи детекції, що використовуються в ВЕРХ, мають більш високу специфічність.
Розглянемо особливості високочутливих методів, що дозволяють аналізувати нанограмові кількості ЛХ (табл.1):
тител з аналізованою речовиною, яка виступає в ролі антигену. Чим вище концентрація речовини-антигену, тим більше утворюється комплекс антиген-антитіло. Для кількісного аналізу комплексоутворення при-
змінюють два підходи – з попереднім відділенням комплексу (гетерогенні методи) або без його відділення (гомогенні методи). У тому та іншому випадку пробу з невідомою концентрацією аналізованої речовини додають до сироватці, в якій антитіло пов'язано в комплекс з міченим аналогом досліджуваної речовини, і речовина з проби, що аналізується, витісняється з комплексу. Кількість витісненого міченого аналога пропорційно концентрації речовини у пробі. Визначивши, скільки міченого аналога виявилося витіснено з комплексу (або, навпаки, залишилося пов'язаним), можна розрахувати потрібний рівень речовини в пробі. Попередньо проводиться калібрування з використанням стандартних розчинів (зі стандартними концентраціями речовини, що тестується).
Випускаються набори реактивів - звані діагностикуми (антисироватка, з'єднаний із препаратом фермент, субстрат, кофактор, стандартні розчини для калібрування), розраховані на 50-200 аналізів. Для аналізу зазвичай достатньо 0,05-0,2 мл сироватки хворого.
Імуноензимні методи мають високу чутливість і специфічність. Діагностикуми порівняно дешеві та мають більш тривалі терміни придатності, ніж набори для радіоімунних методів. При використанні ІФА усувається необхідність відокремлення комплексу антиген-антитіло - досить складної процедури з відносно високим ризиком помилки. Ім-муноензимний метод може виконуватися в будь-якій лікарняній або поліклінічній лабораторії; розроблено прилади, які забезпечують повну автоматизацію аналізу.
Простота аналізу, висока чутливість, точність, відтворюваність,
помірна вартість апаратури і реактивів - усе це створює перспективу широкого застосування імунологічних методів у медичну практику.
Високоефективна рідинна хромотографія з флуоресцентною детекцією
При ВЕРХ детектор генерує електричний сигнал, сила якого пропорційна концентрації аналізованої речовини, розчиненої в рухомій фазі. У перших рідинних хроматографах (іонообмінних) рухома фаза, що пройшла через колонку, з компонентами проби збиралася в невеликі судини, а потім за допомогою титрометрії, колориметрії, полярографії і т.д. визначалося зміст компонента у цій порції. Іншими словами, процеси поділу проби
та визначення її кількісного складу були поділені в часі та просторі. У сучасному рідинному хроматографі ці процеси забезпечуються одним приладом.
Для детекції компонентів проби може бути використана будь-яка фізико-хімічна властивість рухомої фази (поглинання або випромінювання світла, електропровідність, показник заломлення і т.д.), яке змінюється за наявності в ній молекул сполук, що розділяються. З існуючих 50 фізико-хімічних методів детекції нині активно використовують 5-6.
Чутливість - найважливіша характеристика детектора. Якщо визначати чутливість через подвійну амплітуду шуму нульової лінії, а шум виражати у фізичних одиницях, то чутливість фотометричного детектора виражатиметься в одиницях оптичної щільності, рефрактометричного – в одиницях показника заломлення, вольтам-перометричного – в амперах, кондуктометричного – в амперу. У фармацевтичному аналізі чутливість виражають у мінімальній кількості речовини, що визначається. Ступінь чутливості різних типів детекторів наведено у табл. 1.
Незважаючи на те, що в даний час 80% хроматографів оснащено в базовій комплектації спектрофотометричних детекторів, все більшого поширення набуває флуоресцентна детекція, особливо при визначенні концентрації сполук, здатних «світитися» під дією збуджуючого випромінювання. Інтенсивність люмінесценції пропорційна інтенсивності збуджуючого світла. Дослідження спектрів випромінювання (флуоресценції та фосфоресценції) - більш чутливий та специфічний метод, ніж дослідження спектрів поглинання.
Спектр флуоресценції речовини у багатьох випадках є дзеркальним відображенням смуги поглинання з найменшою енергією і зазвичай розташовується поруч із цією смугою з її довгохвильової сторони. Даний метод найбільш зручно застосовувати при дослідженні лікарських препаратів, що мають власну флуоресценцію (хлорохін, доксорубіцин, доксазозин, атенолол, індометацин, пропранолол, тетрацикліни, хінідин та ін.). Деякі ЛВ можна порівняно легко перетворити на флуоресцентні сполуки (процес дериватизації), наприклад гідрокортизон (обробка сірчаною кислотою), меперидин (конденсація з формальдегідом), 6-меркап-топурин та метотрексат (окислення перманганатом калію). Інші препарати з активними функціональними групамиможна конденсувати з флуоресцентними реа-
гентами - флуорескаміном (хлордеазепок-сид, новокаїнамід, сульфаніламіди та ін), 7-нітробензо-2,1,3-оксадіазолом (пропокси-фен та ін) і т.д. Водночас необхідно зазначити, що за високої чутливості та селективності флуоресцентні методидетектування обмежені колом ЛХ, що мають природну флуоресценцію, а процес дериватизації при кількісному аналізі потребує великих витрат.
Високоефективна рідинна хроматографія з мас-спектрометричною детекцією
Високочутливим варіантом сучасного детектора для ВЕРХ, що застосовується для фармакокінетичних досліджень, є мас-спектрометрометр. Мас-спектрометричний детектор дозволяє значно скоротити час аналізу, зокрема, за рахунок виключення підготовчої стадії (екстракції). Даний метод дає можливість одночасно ідентифікувати кілька речовин, і це виключає помилки, пов'язані з наявністю компонентів, що не розділяються.
Мас-спектрометрія – один із найбільш перспективних методів фізико-хімічного аналізу лікарських засобів. Традиційно органічна мас-спектрометрія використовується для вирішення двох основних проблем: ідентифікації речовин та вивчення фрагментації іонізованих молекул у газовій фазі. Сполука мас-спектрометра з рідинним хроматографом значно розширила можливості класичного методу. З появою нових методів іонізації, таких як «електроспрей» (ESI – англ. electrospray ionization) – іонізація в електричному полі при атмосферному тиску) та «МАЛДІ» – іонізація лазерною десорбцією, список молекул, які можуть бути вивчені даним методом, значно розширився.
В даний час комбінація ВЕРХ та мас-спектрометричного детектора з «електроспреєм» знайшла широке поширення у дослідженні фармакокінетики та біоеквівалентності лікарських препаратів. Спочатку метод ESI розробили під керівництвом Л.Н. Галль, а в 2002 р. Д. Фен-ну і К. Танаке була присуджена Нобелівська премія за розробку методів ідентифікації та структурного аналізу біологічних макромолекул і, зокрема, методів мас-спектрометричного аналізу біологічних макромолекул. У механізмі утворення іонізованих частинок виділяють три стадії. Перша – утворення заряджених крапель на зрізі капіляра. За допомогою напруги відбувається перерозподіл заряду в розчині, позитивні іони скап-
ливаються біля виходу. При сильному прикладеному полі (3-5 кВ) утворюється струмінь з вершини конуса, який далі розлітається на дрібні краплі. Друга стадія - поступове скорочення розмірів заряджених крапель за рахунок випаровування розчинника та подальшого розпаду крапель аж до отримання істинних іонів. Заряджені краплі рухаються крізь атмосферу до протилежного електрода. Третя стадія - цикли поділу і зменшення обсягу крапель, що повторюються, до повного випаровування розчинника і утворення іонів у газовій фазі.
Сучасні РХ-МС системи (LC/MS - англ. liquid chromatography/mass-spectrometry) дозволяють реєструвати повний іонний струм (TIC - англ. total ion current), проводити контроль заданих іонів (SIM - англ. реакцій селективне моніторування реакції (SRM – англ. selected reaction monitoring).
При аналізі повного іонного струму (TIC) отримують дані про всі сполуки, що послідовно виходять з хроматографічної колонки. Мас-хроматограми нагадують хроматограми з УФ детекцією, при цьому площа під піком відповідає кількості речовини. При визначенні заданих іонів (SIM) оператор може обмежити діапазон детекції необхідних сполук, виділивши, наприклад, мінорні речовини. Найбільшу чутливість і специфічність має SRM-метод, коли реєстрація іонного струму йде по одному обраному іону, характерному для досліджуваного з'єднання (при ESI-іонізації та реєстрації позитивних іонів це, як правило, молекулярний іон МН+).
У нещодавно опублікованих роботах обговорюється можливість кількісного аналізу органічних речовин у біологічних об'єктах без хроматографічного поділу за допомогою мультионної детекції та внутрішнього контролю у вигляді міченого дейтерієм аналога. Зокрема, для молекул ліпідної природи визначено діапазон концентрацій (від пико- до наномолей), за якого автори спостерігали лінійну залежність інтенсивності іонного струму від концентрації речовини. Збільшення концентрації сполук у розчині призводило до іон-молекулярних взаємодій у процесі іонізації та порушення лінійності.
Описаний метод кількісного визначення простагландинів та поліненасичених жирних кислот з використанням електроспрей-іонізації - мас-спектрометрії без хроматографічного поділу із застосуванням внутрішнього стандарту та реєстрації негативних іонів. В роботі
Ю.О. Каратассо та І. В. Логунової чутливість мас-спектрометрії при дослідженні потенційного антиаритмічного засобу склала 3 нг/0,5 мл плазми крові.
При виборі аналітичного методу необхідно на увазі, що використання ІФА лімітується наявністю обов'язкових реактивів, флуоресцентної детекції, необхідністю власної флуоресценції у досліджуваного з'єднання. Хоча при мас-спектрометричній детекції вищезгадані обмеження несуттєві, проте вартість обладнання на сьогоднішній день залишається досить високою, і даний вид аналізу потребує спеціальних навичок.
ЛІТЕРАТУРА
1. Александров М.Л., Галль Л.М., Краснов Н.В. та ін Екстракція іонів з розчинів при атмосферному тиску - новий метод мас-спектрометричного аналізу // Докл. Акад. наук СРСР. – 1984. – Т.277. - № 2. -
2. Каратассо Ю.О, Логунова І.В., Сергєєва М.Г. та ін. Кількісний аналіз лікарських препаратів у плазмі крові з використанням електроспрей іонізації - мас-спектрометрії без хроматографічного поділу // Хім. фарм. журн. – 2007. – № 4. – С. 161-166.
3. Каратассо Ю.О, Альошин С.Є., Попова Н.В. та ін Кількісний аналіз простагландинів та поліне-насичених жирних кислот методом мас-спектро-метрії з іонізацією електророзпорошенням // Мас-спектрометрія. -2007. - Т.4. - У 3. – С. 173-178.
4. Холодов Л.Є, Яковлєв В.П. Клінічна фармакокінетика. - М:Медицина, 1985. - 463 с.
5. Covey T.R., Lee E.D., Henion J.D. High-speed liquid chromatography/tandem mass spectrometry for determination of drogs in biological samples // Anal. Chem. – 1986. – Vol. 58 (12). – P. 2453-2460.
6. Конференція report на аналітичні методи validation: bioavailability, bioequivalence і фармакокінетичні studies // J. Pharmac. sci. – 1992. – Vol.81. – P. 309-312.
7. De Long CJ, Baker PS, SamuelM. та ін. Molecular species composition of rat liver phospholipids ESI-MS/ MS: Ефект chromatography//J. Lipid Res. – 2001. – Vol. 42. – P. 1959-1968.
8. Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Ed. R.B.Cole// Wiley. - New York, 1997.
9. Han X., Yang K., Yang J. та ін. Factors influencing electrospray intrasource separation і selective ionization glycerophospholipids // Am. Soc. Mass Spectrom. – 2006. – Vol. 17(2). – P. 264-274.
10. Koivusalo M., Haimi P., Heikinheimo L. та ін. Quantitative determination of phospholipids compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response // J. Lipid Res. – 2001. – Vol. 42. – P. 663-672.
11. Lee M.S., Kerns E.H. LC/MS applications in drug discovery//Mass Spectrom. Rev. – 1999. – Vol. 18 (3-4). – P. 187-279.
Надійшла 28.05.10.
ANALYSIS OF DRUGS IN PHARMACOKINETIC STUDIES
DV. Reikhart, V.V. Чистаков
Виявлений був наслідком чутливих і специфічних аналітичних методів для вивчення фармакокінетичних методів. Shown були розпорядження і обмеження імунітему-аналізу, високої ефективності хімічної хроматографії з fluorescence і масою спектрометричної відкриття. Використання методу в ході лікування фармакокінетичних методів у всіх випадках слід визначити, що структура комп'ютера та laboratory equipment.
Key words: хімічна хроматографія, fluorescence і маса спектрометричної відкриття, імуно-enzyme аналізу, фармакокінетики.