Popieriaus chromatografijos metodas reiškia plokščiąją chromatografiją, ji pagrįsta analizuojamų medžiagų pasiskirstymu tarp dviejų nesimaišančių skysčių.
Pasidalijimo chromatografijoje medžiagos išsiskiria dėl komponentų pasiskirstymo koeficientų skirtumo tarp dviejų nesimaišančių skysčių. Medžiaga yra abiejose fazėse tirpalo pavidalu. Stacionari fazė yra laikoma chromatografinio popieriaus porose, nesąveikaujant su ja; popierius veikia kaip stacionarios fazės nešiklis.
Chromatografinio popieriaus tipai:
1) hidrofilinis popierius sulaiko iki 22% vandens porose; stacionari fazė yra vanduo, judrioji fazė yra organinis tirpiklis; toks popierius naudojamas vandenyje tirpioms medžiagoms nustatyti.
2) hidrofobinis popierius atstumia vandenį, todėl yra impregnuojamas nepoliniu organiniu tirpikliu (stacionari fazė); judrioji fazė yra vanduo; toks popierius naudojamas nustatant vandenyje netirpius junginius (riebaluose tirpias rūgštis, vitaminus).
Chromatografiniam popieriui taikomi šie reikalavimai:
¨ cheminis grynumas;
¨ cheminis ir adsorbcijos neutralumas analizuojamų medžiagų ir judriosios fazės atžvilgiu;
¨ tankio vienodumas;
¨ ta pati pluoštų orientacija.
Chromatogramai gauti lašas analizuojamo mišinio užlašinamas ant popieriaus. Popierius dedamas į chromatografinę kamerą, jo galas panardinamas į indą su eliuentu. Tirpiklis juda popieriumi, analizuojamų medžiagų mišinys pasiskirsto tarp judriosios ir stacionarios fazės ir atsiskiria ant popieriaus dėmių ar juostelių pavidalu. Komponentų zonų padėtis nustatoma išvystant chromatografinį popierių su atitinkamais reagentais, kurie sudaro spalvotus junginius su atskiriamais mišinio komponentais.
Gebėjimui atskirti medžiagas chromatografinėje sistemoje kiekybiškai įvertinti naudojamas pasiskirstymo koeficientas Kp – medžiagos koncentracijos stacionarioje ir judrioje fazėje santykis. Eksperimentiškai nustatyti pasiskirstymo koeficientus šiuo metodu neįmanoma, norint įvertinti gebėjimą atskirti medžiagas popieriuje, naudojamas poslinkio (mobilumo) koeficientas R f. Poslinkio koeficientas yra lygus medžiagos judėjimo greičio () ir judriosios fazės judėjimo greičio () santykiui. Eksperimentiškai R f reikšmė randama kaip atstumo X, kurį nukeliauja medžiaga, ir atstumo X f, kurį tirpiklis nukeliauja nuo pradžios iki priekinės linijos, santykis:
.
Koeficientas R f svyruoja nuo 0 iki 1,00. R f reikšmė priklauso nuo analitės pobūdžio, chromatografinio popieriaus tipo, tirpiklio kokybės ir pobūdžio, mėginio panaudojimo būdo, eksperimento technikos ir temperatūros. Koeficientas R f nepriklauso nuo analitės koncentracijos ir kitų komponentų buvimo.
Identifikavimas pagal chromatogramą atliekama šiais būdais:
¨ tiriamųjų ir standartinių chromatogramų medžiagų zonų būdingos spalvos vizualinis palyginimas;
¨ matuojant etalono ir analitės judrumo koeficientus R f konkrečiame tirpiklyje. Chromatografija ir R f nustatymas tiriamiesiems ir standartiniams mišiniams atliekami ant to paties popieriaus ir toje pačioje kameroje griežtai identiškomis sąlygomis. Palyginus koeficientus R f , padaryti išvadą apie tam tikrų komponentų buvimą analizuojamame mišinyje.
kiekybinis įvertinimas atliekama tiesiogiai pagal chromatogramą arba išplaunant (eliuuojant) analitę iš popieriaus.
Kiekybinės analizės metodai:
¨ tiriamųjų ir standartinių chromatogramų dėmių spalvos intensyvumo vizualinis palyginimas (pusiau kiekybinis nustatymas, tikslumas 15–20%);
¨ išmatuoti šio komponento suformuotos dėmės plotą ir rasti medžiagos koncentraciją pagal kalibravimo grafiką, sudarytą standartinių tirpalų serijai koordinatėse: dėmės plotas - medžiagos koncentracija; nustatymo tikslumas 5 - 10 %;
¨ analitės eliuavimas nuo chromatogramos paviršiaus ir spektrofotometrinis arba fluorimetrinis eliuato optinio tankio matavimas (A); medžiagos koncentracija tirpale apskaičiuojama pagal formulę:
čia K yra proporcingumo koeficientas; S yra taško plotas, išmatuotas iš anksto, mm2; nustatymo tikslumas 1%.
Pagal chromatografijos metodą išskiriama didėjanti (21 pav.), mažėjanti (22 pav.), žiedinė (23 pav.), gradientinė ir dvimatė chromatografija.
Popieriaus chromatografijos metodas plačiai naudojamas nustatant neorganinius junginius, aminorūgštis, aminus, baltymus, angliavandenius, riebalų rūgštys, fenoliai, vitaminai chemijos, maisto, farmacijos pramonėje, medicinoje, biochemijoje.
Metodas buvo pritaikytas beveik visų maisto produktų analizei: cukraus gamyboje – angliavandenių kiekiui nustatyti; kepykloje ir konditerijoje - aminorūgštys, organinės rūgštys, angliavandeniai, polisacharidai ir karbonilo junginiai; vyno gamyboje – organinės rūgštys ir aminorūgštys; pieno ir pieno produktų gamyboje – aminorūgštys; mėsos perdirbimo pramonėje - fenoliai, riebalų ir lakiosios rūgštys, aminorūgštys ir karbonilo junginiai.
Tirpiklio (eliuento) sraute. Chromatograma šiuo atveju vadinama chromatografijos vietos paveikslu. popieriuje po atskyrimo. Popieriaus chromatografijoje Ch. arr. specialistas. chromatografinis popierius, kraštai turi būti kuo vienodesni ir juose turi būti tik celiuliozės pluoštai. Jis gali tarnauti kaip stacionari fazė arba kaip inertiškas stacionarios fazės nešiklis.
Paskirstytoje popieriaus chromatografijoje stacionarioji fazė yra vanduo, adsorbuotas popieriaus arba nepolinės org. p-tirpikliai, to-rymi impregnuotas popierius (pasirinktinai su atvirkštinėmis fazėmis), o eliuentas - resp. mišiniai org. tirpalai su vandeniu, dažnai taip pat turintys to-you, kompleksuojantys ir pan. in-va, arba vandens tirpalai inorg. to-t ir druskos. Komponentų judėjimo greitis priklauso nuo koeficiento. jų pasiskirstymas tarp fazių ir pagal šių fazių tūrių santykį.
Praktikoje dažnai vienu metu įgyvendinamos kelios. atskyrimo mechanizmai. Popieriaus chromatografija atliekama stiklo chromatografija. kameros ar kiti uždari indai. Siekiant pagerinti atkuriamumą, jie dažnai kondicionuojami padengiant vidų. sienos su filtravimo popieriumi, sudrėkintu atitinkamu tirpalu. Į kamerą įdedamas padėklas su eliuentu, į kurį nuleidžiamas chromatografinis kraštas. popierių po to, kai ant jo užtepamas atskiriamos in-in mėginys (dažniausiai 1-10 μl tūris). Eliuentas juda veikiamas kapiliarų ir gravitacijos. pajėgos. Pagal popieriaus vietą ir eliuento srovės kryptį išskiriama kylanti, mažėjanti ir horizontali popierinė chromatografija. Chromatografija taip pat gali būti atliekama išcentriniame lauke arba temperatūros gradiento sąlygomis, o tai padidina atskyrimo efektyvumą ir greitį. Taip vadinamoje. Atliekant dvimatę popieriaus chromatografiją, mėginys uždedamas ant vieno iš kvadratinio lapo kampų, o baigus chromatografiją viename eliuente, popierius išdžiovinamas ir, pasukdamas 90° kampu, panardinamas į kitą eliuentą. Dvimatėje chromatogramoje gaukite iki n 2 chromatografijos. zonos, kur ir yra įprastinės (vienmatės) popieriaus chromatografijos metu susidariusių zonų skaičius.
Pakėlus tirpiklį iki tam tikro aukščio, popierius išimamas iš kameros, išdžiovinamas ir atskleidžiama chromatografija. zonos. Jei zonos nespalvotos, chromatograma apipurškiama specifiniais tirpalais. reagentai, sudarantys spalvotus arba fluorescencinius junginius su atskirtais mišinio komponentais. Taip pat naudojami fermentiniai ir biol. aptikimo metodais, pavyzdžiui, fermentams identifikuoti, chromatograma apdorojama atitinkamų substratų tirpalu. Radioaktyviosios medžiagos aptinkamos chromatogramą paveikus rentgeno juostele.
Chromatografijos padėtys popieriaus chromatografijos zonos apibūdinamos R f reikšme, nurodant centrinės chromatografijos nueito kelio santykį. zonos, į kelią, kurį kerta p-tirpiklio priekis: R f \u003d 1 /, kur K s ir V t yra atitinkamai tūriai. stacionarios ir judriosios fazės, K d -koeficientas. pasiskirstymas in-va tarp šių fazių. R f paklaida apytiksl. 5 proc. Standartizuotomis sąlygomis ši vertė yra pastovi kiekvienai in-va ir naudojama jai identifikuoti.
Kiekis. analizė atliekama tiesiogiai chromatogramose arba atskyrus chromatografines salas. zonos nuo celiuliozės pagrindo. Pirmuoju atveju komponentai nustatomi naudojant skenuojančią densitometriją, fluorimetriją, fotometriją arba pagal chromatografinį dydį. zonos, taip pat aktyvinimas. metodai (naudojant paskutinius du būdus zonos išpjaunamos iš anksto). ribos aptikimas in-in spalvotų darinių zonose jie yra 0,1-10 µg, fluorimetriškai -10 -3 -10 -2 µg, aktyvinimo būdu - 10 -4 -10 -10 µg. Komponentai atskiriami nuo celiuliozės pagrindo ekstrahuojant, deginant popierių arba jį verdant mišiniai į-t. Tada komponentai nustatomi bet kokiu tinkamu metodu, dažniausiai spektrofotometriniu, titrimetriniu arba kinetiniu. Kiekio klaida. analizė neviršija 10%.
Norint atskirti mišinio komponentus popieriaus chromatografijos būdu, lašelis tiriamo mėginio uždedamas ant filtrinio chromatografinio popieriaus juostelės 2–4 cm atstumu nuo jos galo, o juostelės galas panardinamas į tirpiklį, kuris pradeda judėti. išilgai popieriaus, veikiant kapiliarinėms jėgoms. Siekiant išvengti popieriaus išsausėjimo, mobilioji fazė paprastai prisotinama vandens. Judant judriajai fazei, bandinio komponentai, nusodinti ant popieriaus netoli pradžios, pasiskirsto tarp judančio tirpiklio ir celiuliozės laikomos vandens plėvelės. Šiuo atveju komponentai juda skirtingu greičiu zonų pavidalu, kurių dydis paprastai yra šiek tiek didesnis nei pradinės dėmės dydis. Popieriaus chromatografija paprastai atliekama uždarame inde (1 pav.), kad chromatografijos metu neišgaruotų tirpiklis. Taikant kylančiąją chromatografiją, viršutinis popieriaus juostelės galas tvirtinamas laikiklyje, o apatinis nuleidžiamas į tirpiklį, kuris pilamas į žemą kiuvetę arba Petri lėkštelę, esančią indo, kuriame atliekama chromatografija, apačioje. išeiti. Šiems tikslams galite naudoti ir didelį matavimo cilindrą, ant kurio dugno pilama mobilioji fazė, o viršus uždengtas stiklu.
Ryžiai. vienas - Chromatografija ant popieriaus: A - didėjanti chromatograma; B - mažėjanti chromatograma; 1 - indas chromatografijai; 2 - rezervuaras su tirpikliu; 3 - chromatografinis popierius; 4 - atskaitos taškai; 5 - atskirti komponentai; 6 - tirpiklio priekis
Atliekant apatinę chromatografiją, tirpiklis juda žemyn popieriumi iš tirpiklio rezervuaro, esančio indo viršuje. Tokiu būdu atskiri komponentai gali būti eliuuojami.
Popieriaus chromatogramų kūrimas iš esmės nesiskiria nuo aprašyto plonasluoksnėms.
Popieriaus chromatografijos efektyvumas priklauso ir nuo popieriaus rūšies, ir nuo judriosios fazės sudėties. Popieriaus rūšys skiriasi akytumu, storiu, hidratacijos laipsniu. Pagal judėjimo greitį tirpikliai skiria greitą, vidutinį ir lėtą popierių. Dažniausiai pasitaikantys chromatografiniai popieriai yra Leningrado, vatmano ir kt.
Dažniausios tirpiklių sistemos yra: CH3COOH-H2O (15:85 tūrio), 1-butanolis - CH3COOH-H20 (4:1:5), 2-propanolis - NH3 (konc.) - H2O (9:1:2) , 1 -butanolis - 1,5 n. NH3 (1:1), fenolis - vanduo ir kt. Judančios fazės sudėtis dažniausiai parenkama eksperimentiniu būdu arba remiantis žinynuose ar monografijose apie popieriaus chromatografiją pateiktais duomenimis.
Naudojant jonų mainų popierių, galima derinti popieriaus chromatografijos ir jonų mainų privalumus. Toks popierius gaunamas sumaišius jonų mainų dervą su popieriui gaminti naudojama celiulioze.
Popieriaus chromatografija yra labai svarbi kokybinei analizei. Jo naudojimas kiekybinėje analizėje yra ribotas.
Popieriaus chromatografija. Iš pirmo žodžio supranti, kad tai kažkas susiję su popieriumi; o antrasis žodis „chromatografija“ reiškia „spalva“ (chromas) ir „rašymas“ (grafika). Sulenkite juos ir gausite „parašyk spalvotai ant popieriaus“.
Popieriaus chromatografija yra svarbiausias mokslo testas. Atidžiai analizuodamas cheminės medžiagos sudėtį pagal spalvą, mokslininkas gali lengvai nustatyti pradines medžiagas. Nesunku pastebėti, kad chromatografija, kurią tikrai verta studijuoti, veikia būtent per kapiliarinį efektą – tai, kaip vanduo pasklinda popieriuje.
Kolonėlė - turi chromatografinį sorbentą, atlieka mišinio atskyrimo į atskirus komponentus funkciją. Eliuentas – judri fazė: dujos, skystis arba (rečiau) superkritinis skystis. Stacionari fazė – kieta fazė arba skystis, surištas ant inertinio nešiklio, adsorbcinėje chromatografijoje – sorbento. Chromatograma yra komponentų koncentracijos prie kolonėlės išėjimo laiko priklausomybės registravimo rezultatas. Detektorius – prietaisas, skirtas fiksuoti mišinio komponentų koncentraciją kolonėlės išėjimo angoje. Chromatografas – chromatografijos prietaisas.
Žemyn nukreipta chromatografija Metodas, kai judanti fazė juda žemyn Aukštyn nukreipta chromatografija Metodas, kai judanti fazė juda aukštyn Horizontali chromatografija Metodas, kai judanti fazė juda horizontaliai. judriosios fazės judėjimas tęsiasi net tada, kai priekis pasiekia popieriaus galą. Rechromatografija Metodas, kai baigus pirmąjį judriosios fazės paleidimą, chromatograma išdžiovinama ir chromatografija kartojama (kartais kelis kartus). medžiagoms aptikti chromatogramoje Carrier Chromatografinis popierius
Stacionari (stacionari) fazė Ant nešiklio pritvirtinta fazė Mobili (mobili) fazė Fazė, užtikrinanti atskirtinų medžiagų judėjimą ant nešiklio su stacionaria faze Pradinė vieta, kur uždedamas tiriamasis mėginys
Popieriaus chromatografijoje naudojamas specialių rūšių popierius, besiskiriantis skaičiumi, kuriam didėjant didėja popieriaus tankis. Popierius sulaiko vandenį porose, kuri yra stacionari skystoji fazė. Mėginio tirpalas lašinamas ant popieriaus lapo tam tikru atstumu nuo krašto. Išgarinus tirpiklį, lakšto kraštas dedamas į sandarią kamerą, kurioje yra ryškalas – judri skystoji fazė (pavyzdžiui, alkoholiai, ketonai, fenoliai, anglies tetrachloridas, chloroformas ir kiti jų mišiniai, taip pat mišiniai su neorganinėmis medžiagomis). tirpikliai). Tokiu atveju pradinė dėmė juda išilgai ryškalo srovės ir mišinys suskaidomas į komponentus. Jei medžiagos nėra spalvotos, chromatograma sukuriama, pavyzdžiui, purškiant indikatoriniu tirpalu, tiriama ultravioletiniais spinduliais ir pan. Atstumo Rf, kurį nukeliauja taškas I, ir atstumo, kurį nukeliauja dėmės priekis, santykis. kūrėjas m, esant tokioms pačioms eksperimentinėms sąlygoms, yra pastovią vertę; Įvairių medžiagų Rf skiriasi reikšme ir gali būti naudojamas junginiams identifikuoti.
Klasifikacija Popieriaus chromatografija, kaip ir apskritai chromatografija, gali būti skirstoma į paskirstomąją adsorbciją Normalią (metodas naudojamas lipofilinėms medžiagoms atskirti.) jonų mainų atvirkštinės fazės preparatinė analitinė.
Įvairių medžiagų kiekybiniai nustatymai chromatogramos dėmėse atliekami įprastiniais analizės metodais. Yra: vienmatės, dvimatės, apskritos, kolonėlės ir elektroforetinės chromatogramos.
I. Adsorbcinė chromatografija pagrįsta atskirų analizuojamo mišinio komponentų selektyvia adsorbcija atitinkamais adsorbentais. Dirbant šiuo metodu, analizuojamas tirpalas perleidžiamas per kolonėlę, užpildytą smulkiais adsorbento grūdeliais. Adsorbcinė chromatografija naudojama neelektrolitams, garams ir dujoms atskirti. II. Pasiskirstymo chromatografija pagrįsta atskirų analizuojamo mišinio komponentų sorbcijos koeficientų skirtumu tarp dviejų nesimaišančių skysčių. Vienas iš skysčių (stacionarių) yra akytos medžiagos (nešiklio) porose, o antrasis (mobilus) yra kitas tirpiklis, kuris nesimaišo su pirmuoju.
Šis tirpiklis mažu greičiu leidžiamas per kolonėlę. Skirtingos pasiskirstymo koeficientų reikšmės užtikrina skirtingą judėjimo greitį ir mišinio komponentų atskyrimą. Medžiagos pasiskirstymo tarp dviejų nesimaišančių tirpiklių koeficientas yra medžiagos koncentracijos judančiame tirpiklyje ir tos pačios medžiagos koncentracijos nejudančiame tirpiklyje santykis:
Kartais vietoj kolonėlės kaip nejudamojo tirpiklio nešiklis naudojamos filtravimo popieriaus juostelės ar lakštai, kuriuose nėra mineralinių priemaišų. Tokiu atveju lašelis tiriamojo tirpalo užlašinamas ant popieriaus juostelės krašto, kuri pakabinama uždaroje kameroje, nuleidžiant jos kraštą lašeliu tiriamojo tirpalo į indą su mobiliu tirpikliu ( variklis), kuris, judėdamas išilgai popieriaus, jį sušlapina. Šiuo atveju kiekviena medžiaga, esanti analizuojamame mišinyje, juda būdingu greičiu ta pačia kryptimi, kaip ir judėjimo medžiaga.
ypatinga rūšis pasiskirstymo chromatografija yra dujų skysčių chromatografija (GLC). Įvairūs nelakūs skysčiai, laikomi ant inertiško kieto nešiklio, naudojami kaip stacionari fazė; kaip judrioji fazė, dujinis azotas, vandenilis, helis, anglies dioksidas ir kt. Mišinių atskyrimas GLC metodu atliekamas kolonėlėse, kurios yra 16 mm vidinio skersmens ir 15 m ilgio vamzdeliai, užpildyti inertiškas nešiklis, pavyzdžiui, diatomitas, impregnuotas nelakiu skysčiu, arba plieniniai ir stikliniai kapiliarai, kurių skersmuo 0,2–0,3 mm ir ilgis 25 100 m su skysta faze, nusėdusia ant šių kapiliarų sienelių (kapiliarinės dujos). -skysčių chromatografija).
. Jonų mainų chromatografija pagrįsta jonų mainų procesų, vykstančių tarp judriųjų adsorbentų jonų ir elektrolito jonų, naudojimu, kai analitės tirpalas leidžiamas per kolonėlę, užpildytą jonų mainų medžiaga (jonų keitikliu). Jonaičiai yra netirpūs neorganiniai ir organiniai didelės molekulinės masės junginiai, turintys aktyvių (joninių) grupių. Šių grupių judrūs jonai, susilietus su elektrolitų tirpalais, gali būti pakeisti tirpios medžiagos katijonais arba anijonais. Kaip jonų mainai naudojami aliuminio oksidas (chromatografijai), permutinas, sulfonintos akmens anglys ir įvairios jonų mainų medžiagos, jonų mainų dervos. Jonų keitikliai skirstomi į katijonų keitiklius, galinčius keistis katijonais (jose yra aktyvių grupių: SO 3 H, COOH, OH); anijonų mainai, galintys keistis anijonais (aktyviosios grupės: NH 2, =NH); amfolitai yra jonų mainų medžiagos, turinčios amfoterinių savybių.
IV. Nuosėdų chromatografija pagrįsta skirtingu tirpumu nuosėdų, susidarančių dėl įvairių analizuojamo mišinio komponentų, naudojant specialius reagentus, uždedamus labai dispersinei medžiagai. Analizuojami tirpalai leidžiami per kolonėlę, užpildytą poringa medžiaga (nešikliu). Nešiklis yra impregnuotas nusodinamuoju reagentu, kuris sudaro nuosėdas su skirtingo tirpumo tirpalo jonais. Susidariusios nuosėdos, priklausomai nuo tirpumo, išsidėsto tam tikra seka išilgai kolonėlės aukščio.
V. Dydžio išskyrimo (molekulinio sieto) chromatografija pagrįsta skirtingu komponentų molekulių pralaidumu stacionariai fazei (labai porėtam nejoniniam geliui). Dydžio išskyrimo chromatografija skirstoma į gelinio pralaidumo chromatografiją (GPC), kurioje eliuentas yra nevandeninis tirpiklis, ir gelio filtravimą, kai eliuentas yra vanduo.
Įlašinę lašelį raudono ir mėlyno rašalo mišinio į sudrėkinto filtravimo popieriaus lapo centrą ir atsargiai nulašinę švaraus vandens, netrukus gausite lygiai tą patį vaizdą. Žemiau yra šešių skirtingų aminorūgščių mišinio žiedinė chromatograma ant popieriaus,
sukurta keturiais skirtingais reagentais. Viršuje dešinėje yra dar sudėtingesnio keturiolikos skirtingų aminorūgščių mišinio 2D chromatograma. Ši chromatograma buvo gauta iš vieno lašo rūgščių mišinio tirpalo, užlašinus apskritimu pažymėtame taške. Kūrimas buvo vykdomas pakaitomis dviem kryptimis naudojant skirtingus reagentus. Kiekviena etiketės vieta priklauso vienai aminorūgščiai. Pagal dėmės spalvą ir padėtį galima visiškai tiksliai nustatyti medžiagos pobūdį. Viršuje kairėje – įprastos rašalo dėmės ant blotingo popieriaus chromatograma.
Chromatogramų kūrimas Chromatogramos komponentų kūrimas atliekamas vienu iš toliau nurodytų metodų. Fizikiniai metodai (Vizualiai, dienos šviesoje, chromatogramoje pažymėkite spalvotų medžiagų dėmių padėtį. Esant fluorescencinėms medžiagoms, ryškinimas atliekamas UV šviesoje.) Cheminiai metodai (Chromatogramos kuriamos skystais ir dujiniais ryškalais, naudojant chromatogramoje esančių junginių reakcija su tinkamu ryškalo reagentu, kad susidarytų spalvota arba fluorescencinė medžiaga (skysti ryškalai naudojami purškimo buteliuku arba naudojami aerozoliniai reagentai, dujiniai naudojami chromatogramą patalpinus į ryškalo garus .)
Chromatograma dedama horizontaliai ant filtravimo popieriaus lapo arba paliekama pakabinta ant stiklinio strypo ir apipurškiama kuo mažesniais ryškalo lašeliais (rūku) per visą chromatogramos plotą, pirmiausia iš vienos pusės, o paskui iš Kita pusė. Ryškinant dujiniu ryškikliu, chromatograma pakabinama kameroje, kurioje dedamas lakus reagentas (pavyzdžiui, jodo kristalai) arba kurios apačioje ryškalas gaunamas cheminiu būdu (pavyzdžiui, azoto oksidai gaunami pridedant). kieto natrio nitrito į druskos rūgšties tirpalą).
Biologiniai metodai Chromatogramos sukuriamos naudojant chromatografuojamų medžiagų biologinį aktyvumą. Kokybinis chromatogramos įvertinimas – tai dėmės ar juostos padėtis, kuri apibūdinama R f=a/b reikšme, kur a – atstumas nuo mėginio dėmės centro iki pradinės linijos, mm; b – atstumas nuo tirpiklio fronto iki pradinės linijos, mm arba pagal Rx reikšmę: Rx= a/c, kur c – atstumas nuo etaloninės medžiagos dėmės centro iki starto linijos, mm.
Norimo komponento kiekis mėginyje nustatomas lyginant jo dėmės dydį ir spalvos intensyvumą su etaloninės medžiagos dėmėmis, užteptomis ant popieriaus, koncentracijos intervale, nurodyta norminiuose ir techniniuose dokumentuose, skirtuose tiriamajam reagentui. ir apdorojami bandymo sąlygomis. Įvertinimas atliekamas vizualiai arba naudojant aparatūrą (pavyzdžiui, densitometrą, prietaisą, skirtą komponentų dėmėms popieriuje nuskaityti), arba dėmių eliuavimu ir vėliau fotometriniu tirpalų optinio tankio nustatymu. Chromatogramos saugomos tokiomis sąlygomis, kurios neleidžia susidaryti abipusiams chromatogramų atspaudams (pavyzdžiui, naudojant filtravimo popieriaus padėklus). Jei leidžia dėmių pobūdis, ant chromatogramų užtepamas greitai džiūstančio lako sluoksnis. Jei reikia, nubrėžkite chromatogramos arba nuotraukos kontūrą.
POPIERIAUS CHROMATOGRAFIJOS ĮRANGOS PAVYZDŽIAI IR KAIP JĮ NAUDOTI Chromatografijos aukštyn-žemyn kamera 1. Aukštyn-žemyn chromatografijos kamera (1 pav.) Fig. 2. Horizontaliosios chromatografijos kamera (2 pav.) (2 pav.) 1 kamera; 2 stiklo strypų grotelės; 3 stiklinė lazdelė chromatogramos galui paspausti; 4 dangtelis; 5 chromatograma; 6 tirpiklis
Kvailas. 3. Apvalios chromatogramos kamera (dvi Petri lėkštelės) (3 pav.) 1 popierinis dagtis; 2, 4 Petri lėkštelės; 3 apskrita chromatograma; 5 tirpiklis 4. Chromatogramos išdėstymo didėjimo chromatografijoje būdai (4 pav.) 1 chromatograma; 2 chromatografinė kamera; 3 tirpiklis
Kvailas. 5. Popieriaus chromatogramos įterpimo į griovelį 1 chromatograma būdas; 2 startas; 3 stiklinės lazdelės; 4 sulenkta lazda chromatogramai įspausti griovelyje; 5 griovelis
Dvimatė chromatograma gaunama atskiriant vienmatės chromatogramos dėmes su kitu ryškikliu pirmajai dėmių eilei statmena kryptimi. Apvalioje chromatogramoje dėmė, esanti lapo centre, yra neryški išilgai koncentrinių apskritimų. Popierinės kolonėlės chromatografijoje atskyrimas atliekamas popieriniais diskais, sandariai įstatytais į cilindrinę kolonėlę. Elektroforetinėms chromatogramoms gauti popieriaus lapas impregnuojamas elektrolitu, fiksuojamas tarp elektrodų, užtepamas analizuojamas mišinys, elektrodai prijungiami prie šaltinio. nuolatinė srovė ir tuo pat metu ant popieriaus krypčiai statmena kryptimi užtepamas judrus tirpiklis jėgos linijos elektros srovė.
Taikant šį metodą, komponentai atsiskiria dėl nevienodo jų pasiskirstymo tarp dviejų skystųjų fazių ir skirtingas greitis medžiagų judėjimas veikiant elektrinis laukas. Popieriaus chromatografija naudojama neorganinėms ir organinėms medžiagoms atskirti ir analizuoti natūraliose ir pramoninėse medžiagose (pavyzdžiui, nustatyti dervas naftos produktuose, retųjų žemių elementus uolienose ir mineraluose).
Chromatografiniai metodai yra būtini maisto kokybės kontrolei. maistinė vertė Produktai nustatomi analizuojant baltymų aminorūgščių sudėtį, riebalų rūgščių ir gliceridų izomerinę sudėtį riebaluose, angliavandeniuose, organinėse rūgštyse ir vitaminuose. AT pastaraisiais metais daugelis šių analizių atliekamos naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. Produktų saugai įvertinti juose aptinkami maisto priedai (konservantai, antioksidantai, saldikliai, dažikliai ir kt.), nustatomas produktų šviežumas, ankstyvosios stadijos gedimas ir leistinas galiojimo laikas.
Chromatografijos metodais maisto produktuose galima aptikti tokius teršalus kaip pesticidai, nitrozaminai, mikotoksinai (aflatoksinai, ochratoksinas A, zearalenonas ir kt.), daugiabranduoliniai aromatiniai junginiai, biogeniniai aminai, nitratai ir kt. kenksmingų medžiagų iš pakavimo medžiagų, ypač vinilo chlorido, benzeno, plastifikatorių ir kt. mėsos gaminiai nustatyti anabolinius steroidus, hormonus ir kitų rūšių vaistus, kuriais dažniausiai piktnaudžiaujama intensyvioje gyvulininkystėje. Atskira dujų chromatografijos taikymo sritis yra maisto produktų aromato sudėties analizė. Rasta tūkstančiai lakiųjų komponentų, iš kurių vos kelios dešimtys lemia kvapo pobūdį, likusieji suteikia gaminio kvapui ir skoniui individualumo.
Pastaraisiais metais išryškėjo nauja kryptis – enantioselektyvi maisto komponentų analizė. Pagal santykį optiniai izomerai amino rūgštys, hidroksi rūgštys ir kai kurie kiti junginiai, galima vienareikšmiškai nustatyti, ar konkretus produktas yra natūralus, ar jame yra sintetinių imitatorių ir priedų. Enantiomerinė analizė parodė, kad maisto produktų apdorojimas mikrobangų krosnelėje, priešingai nei stiprus terminis apdorojimas, nesukelia aminorūgščių racemizacijos. Tačiau visuose fermentuotuose pieno produktuose yra daug (netoksiško) D-alanino ir D-asparto rūgšties, pieno rūgšties bakterijų atliekų.
Natūraliuose riebaluose vyrauja riebalų rūgščių cis izomerai. Neseniai buvo nustatyta, kad transizomerai padidina MTL ir mažina didelio tankio lipoproteinų kiekį kraujyje, o tai gali prisidėti prie aterosklerozės išsivystymo. Dujų chromatografinio atskyrimo ir visų riebalų rūgščių izomerų analizės technikos sukūrimas privertė gamintojus kelis kartus sumažinti trans izomerų kiekį. nesočiosios rūgštys margarine.
Kai kuriuose sūriuose dujų chromatografijos metodu buvo nustatyta daug nepageidaujamų fiziologiškai aktyvių biogeninių aminų ir šie sūriai buvo uždrausti. Japonijoje L-triptofanas naudojamas maisto produktuose, gaunamas naudojant genų inžineriją ir biotechnologijas. O kai tūkstančiams žmonių buvo aptikta anksčiau nežinoma liga ir mirė dešimtys sergančiųjų, chromatografiniais metodais buvo nustatyta, kad šias tragiškas pasekmes sukėlė triptofane esantys toksiški teršalai (aptikta 60 priemaišų). Vynams, konjakams ir kitiems alkoholio turintiems produktams atliekama dujų chromatografinė analizė.
Dabar grįžkime prie klastotės sviesto. Yra toks aliejus – „valstietis“. Atrodo kaip aliejus kaip aliejus. Kvepia sviestu. Skanus. Pirmiausia buvo nuspręsta patikrinti, kiek jame yra trigliceridų. Tikrame aliejuje trigliceridai sudaro didžiausią visų lipidų masę. Vidutiniškai – 98 proc. Patikrinimui naudojame plonasluoksnės chromatografijos metodą. Naudojame Sorbfil plokštes. Chromatografinė sistema yra pati paprasčiausia – benzenas.
Pasiskirstymo chromatografija grindžiama atskirtų komponentų savybe, kad jie būtų skirtingai pasiskirstę tarp dviejų nesimaišančių arba mažai besimaišančių skystųjų fazių. Viena iš skystųjų fazių yra stacionari fazė, ji tvirtai laikosi ant kietos medžiagos – „nešiklio“ – paviršiaus monomolekulinio skysčio sluoksnio pavidalu. Kitoje fazėje – mobilioje – ištirpinkite ant nešiklio nusėdusį tiriamąjį mišinį.
Chromatografijos procese mišinio medžiagos perskirstomos tarp dviejų nesimaišančių skystų fazių. Atskirų komponentų judėjimo greitis yra skirtingas, todėl juos galima atskirti nuo sudėtingo mišinio. Tyrimų praktikoje plačiausiai naudojamas skaidymo chromatografijos popieriuje metodas.
Paskirstymo chromatografija ant popieriaus. Nešiklis yra ore sausas filtravimo popierius, o jame esantis higroskopinis vanduo yra stacionari fazė. Kaip judrioji fazė naudojami nesimaišantys arba iš dalies su vandeniu besimaišantys organiniai tirpikliai.
Gaunant chromatogramas popieriaus chromatografijos metodu, lašelis tiriamojo tirpalo užlašinamas ant filtravimo popieriaus juostelės krašto, po to juostelė panardinama į specialiai chromatografijai skirtą stiklinę vonią, kurioje yra judrus tirpiklis. Tirpikliui judant per popierių, juda ir atskiri mišinio komponentai, tačiau skirtingu greičiu, o tai užtikrina mišinio atsiskyrimą.
Chromatogramos gaunamos sandariose kamerose atmosferoje, prisotintoje organinio tirpiklio ir vandens garų. Gautos chromatogramos džiovinamos ir atskirtoms medžiagoms sukurti purškiamos (išvystomos) reagentu, kuris su išskirtomis medžiagomis sudaro spalvotus junginius, leidžiančius nustatyti jų vietą ant popieriaus juostelės. Tam tikromis eksperimentinėmis sąlygomis atskirų medžiagų pasiskirstymas abiejose skystosiose fazėse pasižymi pastoviu koeficientu Rf.
Pasiskirstymo koeficientas Rf nustatomas pagal tiriamojo tirpalo nuvažiuoto atstumo (cm) ir tirpiklio nuvažiuoto atstumo (cm) santykį. Rf verčių atkuriamumas priklauso nuo atliekamų tyrimų sąlygų (popieriaus kokybės, tirpiklių grynumo laipsnio, temperatūros, dujinės atmosferos sudėties ir kt.).
Yra keli popieriaus chromatografijos variantai: kylanti – tirpiklis juda iš apačios į viršų, besileidžiantis – tirpiklis juda iš viršaus į apačią ir radialinis (apvalus) – tirpiklis juda iš centro į apskritimą. Be to, naudojama vienmatė ir dvimatė chromatografija; vienmatėje chromatografijoje medžiagų atskyrimas vykdomas viena kryptimi, dvimatėje - dviem viena kitai statmenomis kryptimis.
Vienmatė chromatografija. Vienmatė chromatografija yra pati paprasčiausia ir naudojama paprastiems mišiniams tirti, medžiagos grynumui patikrinti, medžiagoms identifikuoti.
Taikant vienmatę chromatografiją, nustatymo procedūra yra tokia. Tam tikras bandomojo tirpalo kiekis užtepamas ant chromatografinio popieriaus juostelės kelių centimetrų atstumu nuo krašto. Popierius dedamas į tirpiklio vonią kameroje, naudojant chromatografiją prieš srovę arba pasroviui (11 pav.). Tokiu atveju tirpiklis juda į priekį ir, kai iki galo lieka maždaug 2 cm, procesas sustabdomas, chromatograma pašalinama iš kameros, tirpiklio frontas pažymimas ir džiovinamas 100 °C temperatūroje, kad būtų pašalintas tirpiklis.
Chromatograma sukuriama apdorojant specialiu reagentu, o pagal susidariusių spalvotų dėmių vietą chromatogramoje tam tikrai medžiagai nustatomas Rf, atsižvelgiant į atstumą nuo tirpalo uždėjimo pradžios taško iki tirpalo vidurio. atitinkamą vietą. Tada, naudodami specialias lenteles, galite nustatyti, kuri medžiaga (pavyzdžiui, kuri aminorūgštis) atitinka vietą. Paprastai medžiagoms identifikuoti naudojama vienu metu gauta žinomų medžiagų – „liudininkų“ – chromatograma. Sutapus šių chromatogramų dėmių vietai, nustatoma medžiagų tapatybė.
Dvimatė chromatografija. Dvimatė chromatografija naudojama sudėtingiems mišiniams atskirti, pavyzdžiui, apibūdinti aminorūgštis, gautas baltymų hidrolizės būdu. Šis chromatografinis metodas susideda iš to, kad medžiagos atskiriamos dviem etapais, naudojant du tirpiklius viena kitai statmenomis kryptimis.
Radialinė (apvalioji) chromatografija. Radialinei chromatografijai naudojami apvalūs filtrai, kurie paprastu pieštuku padalinami į daugybę vienodo dydžio sektorių ir nubrėžiami du apskritimai - vienas 1 - 1,5 cm atstumu nuo centro, antrasis 5 cm Ant pirmojo apskritimo linijos (pradedant) kiekviename sektoriuje užlašinami tiriamojo tirpalo lašeliai, o antrasis apskritimas yra chromatogramos riba. Popierinio disko centre padaroma skylutė, įkišamas popierinis dagtis, kuris panardinamas į tirpiklį.
Kildamas išilgai popieriaus dagties, tirpiklis pereina į popieriaus diską ir, pasklisdamas per popierių, perneša lašelyje esančius komponentus iš centro į apskritimą. Petri lėkštelės aukštais kraštais naudojamos kaip kameros. Radialinė chromatografija yra paprasčiausias ir greičiausias medžiagų chromatografinio atskyrimo būdas. Taikant šį metodą pasiekiamas didelis atskyrimo efektas.
Atliekant kiekybinę analizę naudojant popieriaus chromatografiją, tam tikras tiriamojo tirpalo tūris užpilamas ant popieriaus. Jei analizuojami tirpalai su maža tiriamų medžiagų koncentracija, tada kelis kartus lašinami lašai, kiekvieną kartą džiovinant užteptą vietą, tada atliekamas chromatografinis atskyrimas.
Dėl kiekybinis įvertinimas izoliuotoms medžiagoms naudojamas toks metodas. Iš gautos chromatogramos išpjaunama pjūvis, kuriame yra išskirta medžiaga, ji eliuuojama tirpikliu ir spektrofotometru arba fotoelektrokolorimetru nustatoma jos koncentracija.