Papīra hromatogrāfijas metode attiecas uz plakanu hromatogrāfiju, tās pamatā ir analizējamo vielu sadalījums starp diviem nesajaucamiem šķidrumiem.
Sadalījuma hromatogrāfijā vielu atdalīšanās notiek, jo atšķiras komponentu sadalījuma koeficienti starp diviem nesajaucamiem šķidrumiem. Viela abās fāzēs ir šķīduma veidā. Stacionārā fāze tiek turēta hromatogrāfiskā papīra porās, ar to nesadarbojoties; papīrs darbojas kā stacionārās fāzes nesējs.
Hromatogrāfiskā papīra veidi:
1) hidrofilais papīrs porās satur līdz 22% ūdens; stacionārā fāze ir ūdens, kustīgā fāze ir organisks šķīdinātājs; šādu papīru izmanto ūdenī šķīstošo vielu noteikšanai.
2) hidrofobs papīrs atgrūž ūdeni, tāpēc tas ir piesūcināts ar nepolāru organisko šķīdinātāju (stacionārā fāze); mobilā fāze ir ūdens; šādu papīru izmanto ūdenī nešķīstošu savienojumu (taukos šķīstošās skābes, vitamīnu) noteikšanai.
Uz hromatogrāfisko papīru attiecas šādas prasības:
¨ ķīmiskā tīrība;
¨ ķīmiskā un adsorbcijas neitralitāte attiecībā uz analizējamajām vielām un kustīgo fāzi;
¨ blīvuma viendabīgums;
¨ tāda pati šķiedru orientācija.
Lai iegūtu hromatogrammu, uz papīra uzklāj pilienu analizētā maisījuma. Papīru ievieto hromatogrāfijas kamerā, tā galu iegremdē traukā ar eluentu. Šķīdinātājs pārvietojas pa papīru, analizējamo vielu maisījums tiek sadalīts starp kustīgo un stacionāro fāzi un tiek atdalīts uz papīra plankumu vai svītru veidā. Komponentu zonu novietojums tiek noteikts, izstrādājot hromatogrāfisko papīru ar atbilstošiem reaģentiem, kas veido krāsainus savienojumus ar maisījuma komponentu atdalīšanu.
Lai kvantitatīvi noteiktu spēju atdalīt vielas hromatogrāfiskā sistēmā, tiek izmantots sadalījuma koeficients Kp - vielas koncentrācijas attiecība stacionārajā un kustīgajā fāzē. Eksperimentāli sadalījuma koeficientu noteikšana ar šo metodi nav iespējama, lai novērtētu spēju atdalīt vielas uz papīra, tiek izmantots pārvietošanās (mobilitātes) koeficients R f. Pārvietojuma koeficients ir vienāds ar vielas kustības ātruma () attiecību pret kustīgās fāzes kustības ātrumu (). Eksperimentāli R f vērtību nosaka kā attāluma X attiecību, ko viela nobrauca, un attālumu X f, ko šķīdinātājs nobrauc no sākuma līdz priekšējai līnijai:
.
Koeficients R f svārstās 0 - 1,00 robežās. R f vērtība ir atkarīga no analizējamās vielas veida, hromatogrāfiskā papīra veida, šķīdinātāja kvalitātes un rakstura, parauga pielietošanas metodes, eksperimenta tehnikas un temperatūras. Koeficients R f nav atkarīgs no analizējamās vielas koncentrācijas un citu komponentu klātbūtnes.
Identifikācija saskaņā ar hromatogrammu veic šādos veidos:
¨ pētāmo un standarta hromatogrammu vielu zonu raksturīgās krāsas vizuāls salīdzinājums;
¨ mērot mobilitātes koeficientus R f standartam un analizējamai vielai noteiktā šķīdinātājā. Hromatogrāfiju un R f noteikšanu testa un standarta maisījumiem veic uz tā paša papīra un tajā pašā kamerā stingri identiskos apstākļos. Salīdzinot koeficientus R f , izdarīt secinājumu par noteiktu komponentu klātbūtni analizētajā maisījumā.
kvantitatīvā noteikšana veic tieši saskaņā ar hromatogrammu vai izskalojot (eluējot) analītu no papīra.
Kvantitatīvās analīzes metodes:
¨ plankumu krāsas intensitātes vizuālais salīdzinājums uz pētāmajām un standarta hromatogrammām (puskvantitatīvā noteikšana, precizitāte 15–20%);
¨ šī komponenta veidotā plankuma laukuma mērīšana un vielas koncentrācijas atrašana saskaņā ar kalibrēšanas grafiku, kas izveidots virknei standartšķīdumu koordinātēs: plankuma laukums - vielas koncentrācija; noteikšanas precizitāte 5 - 10%;
¨ analizējamās vielas eluēšana no hromatogrammas virsmas un eluāta optiskā blīvuma (A) spektrofotometriskā vai fluorimetriskā mērīšana; vielas koncentrāciju šķīdumā aprēķina pēc formulas:
kur K ir proporcionalitātes koeficients; S ir iepriekš izmērītais plankuma laukums, mm2; noteikšanas precizitāte 1%.
Pēc hromatogrāfijas metodes izšķir augošo (21. att.), dilstošo (22. att.), cirkulāro (23. att.), gradientu un divdimensiju hromatogrāfiju.
Papīra hromatogrāfijas metodi plaši izmanto neorganisko savienojumu, aminoskābju, amīnu, olbaltumvielu, ogļhidrātu, taukskābes, fenoli, vitamīni ķīmiskajā, pārtikas, farmācijas rūpniecībā, medicīnā, bioķīmijā.
Metode ir atradusi pielietojumu gandrīz visu pārtikas produktu analīzē: cukura ražošanā - ogļhidrātu noteikšanai; maizes un konditorejas izstrādājumos - aminoskābes, organiskās skābes, ogļhidrāti, polisaharīdi un karbonila savienojumi; vīna darīšanā - organiskās skābes un aminoskābes; piena un piena produktu ražošanā - aminoskābes; gaļas pārstrādes rūpniecībā - fenoli, taukskābes un gaistošās skābes, aminoskābes un karbonila savienojumi.
Šķīdinātāja (eluenta) plūsmā. Hromatogrammu šajā gadījumā sauc par hromatogrāfijas atrašanās vietas attēlu. zonas uz papīra pēc atdalīšanas pabeigšanas. Papīra hromatogrāfijā Ch. arr. speciālists. hromatogrāfija papīrs, malām jābūt pēc iespējas viendabīgākām un satur tikai celulozes šķiedras. Tas var kalpot kā stacionārā fāze vai kā stacionārās fāzes inertais nesējs.
Sadales papīra hromatogrāfijā stacionārā fāze ir ūdens, ko adsorbē papīrs vai nepolāras org. p-šķīdinātāji, to-rymi impregnēts papīrs (opcija ar apgrieztām fāzēm), un eluents - resp. maisījumi org. šķīdumi ar ūdeni, kas bieži satur arī to-you, kompleksu veidošanu utt. in-va, vai ūdens šķīdumi inorg. to-t un sāļi. Komponentu kustības ātrums ir atkarīgs no koeficienta. to sadalījums starp fāzēm un šo fāžu tilpumu attiecība.
Praksē bieži vien tiek īstenoti vairāki vienlaikus. atdalīšanas mehānismi. Papīra hromatogrāfiju veic stikla hromatogrāfijā. kameras vai citi slēgti trauki. Lai uzlabotu reproducējamību, tie bieži tiek kondicionēti, pārklājot iekšpusi. sienas ar atbilstošā šķīdumā samitrinātu filtrpapīru. Kamerā ievieto paplāti ar eluentu, kurā nolaiž hromatogrāfisko malu. papīrs pēc tam, kad uz tā ir uzklāts atdalāms iekšpuses paraugs (parasti 1–10 μl tilpums). Eluents pārvietojas kapilāru un gravitācijas ietekmē. spēkus. Atbilstoši papīra novietojumam un eluenta strāvas virzienam izšķir augošo, dilstošo un horizontālo papīra hromatogrāfiju. Hromatogrāfiju var veikt arī centrbēdzes laukā vai temperatūras gradienta apstākļos, kas palielina atdalīšanas efektivitāti un ātrumu. Tā sauktajā. Divdimensiju papīra hromatogrāfijā paraugu uzklāj vienā no kvadrātveida loksnes stūriem, un pēc hromatogrāfijas pabeigšanas vienā eluentā papīru žāvē un, pagriežot par 90°, iegremdē citā eluentā. Divdimensiju hromatogrammā iegūstiet līdz n 2 hromatogrāfijai. zonas, kur un ir parastās (viendimensijas) papīra hromatogrāfijas laikā izveidoto zonu skaits.
Pēc šķīdinātāja pacelšanas līdz noteiktam augstumam papīrs tiek izņemts no kameras, žāvēts un tiek atklāta hromatogrāfija. zonām. Ja zonas nav iekrāsotas, hromatogrammu izsmidzina ar īpašiem šķīdumiem. reaģenti, kas veido krāsainus vai fluorescējošus savienojumus, atdalot maisījuma sastāvdaļas. Izmanto arī fermentu un biol. noteikšanas metodes, piemēram, lai identificētu fermentus, hromatogrammu apstrādā ar atbilstošo substrātu šķīdumu. Radioaktīvās vielas nosaka, pakļaujot hromatogrammu rentgena plēvei.
Hromatogrāfijas pozīcijas zonas papīra hromatogrāfijā raksturo R f vērtība, kas atspoguļo centra hromatogrāfijas noietā ceļa attiecību. zonām, uz ceļu, ko šķērso p-šķīdinātāja priekšpuse: R f \u003d 1 /, kur K s un V t ir attiecīgi tilpumi. stacionārās un mobilās fāzes, K d -koeficients. sadalījums in-va starp šīm fāzēm. R f kļūda apm. 5%. Standartizētos apstākļos šī vērtība ir nemainīga katrai in-va un tiek izmantota tās identificēšanai.
Daudzums. analīzi veic tieši hromatogrammās vai pēc hromatogrāfisko salu atdalīšanas. zonas no celulozes bāzes. Pirmajā gadījumā sastāvdaļas nosaka, izmantojot skenēšanas densitometriju, fluorimetriju, fotometriju vai hromatogrāfisko izmēru. zonām, kā arī aktivizēšanu. metodes (izmantojot pēdējās divas metodes, zonas tiek iepriekš izgrieztas). robežas atklāšanas in-in krāsaino atvasinājumu zonās tie ir 0,1-10 µg, fluorimetriski -10 -3 -10 -2 µg, ar aktivācijas metodi - 10 -4 -10 -10 µg. Komponentu atdalīšana no celulozes bāzes tiek veikta, ekstrahējot, sadedzinot papīru vai ievārot maisījumi uz-t. Pēc tam sastāvdaļas nosaka ar jebkuru piemērotu metodi, parasti spektrofotometrisko, titrimetrisko vai kinētisko. Daudzuma kļūda. analīze nepārsniedz 10%.
Lai atdalītu maisījuma sastāvdaļas ar papīra hromatogrāfiju, analizētā parauga pilienu uzliek uz filtra hromatogrāfijas papīra sloksnes 2–4 cm attālumā no tā gala, un sloksnes galu iemērc šķīdinātājā, kas sāk kustēties. gar papīru kapilāro spēku iedarbībā. Lai novērstu papīra dehidratāciju, kustīgā fāze parasti ir piesātināta ar ūdeni. Kustīgās fāzes kustības laikā testa parauga sastāvdaļas, kas nogulsnētas uz papīra sākuma tuvumā, tiek sadalītas starp kustīgo šķīdinātāju un ūdens plēvi, ko satur celuloze. Šajā gadījumā sastāvdaļas pārvietojas ar dažādu ātrumu zonu veidā, kuru izmērs parasti ir nedaudz lielāks par sākotnējās vietas izmēru. Papīra hromatogrāfiju parasti veic slēgtā traukā (1. attēls), lai izvairītos no šķīdinātāja iztvaikošanas hromatogrāfijas laikā. Augošā hromatogrāfijā papīra sloksnes augšējais gals tiek fiksēts turētājā, bet apakšējais gals tiek nolaists šķīdinātājā, ko ielej zemā kivetē vai Petri trauciņā, kas atrodas trauka apakšā, kurā tiek veikta hromatogrāfija. ārā. Šiem nolūkiem var izmantot arī lielu mērcilindru, kura apakšā ielej kustīgo fāzi, bet augšpusi pārklāj ar stiklu.
Rīsi. viens - Hromatogrāfija uz papīra: A - augošā hromatogramma; B - dilstošā hromatogramma; 1 - trauks hromatogrāfijai; 2 - rezervuārs ar šķīdinātāju; 3 - hromatogrāfiskais papīrs; 4 - sākuma punkti; 5 - atdalītas sastāvdaļas; 6 - šķīdinātāja priekšpuse
Dūnu hromatogrāfijā šķīdinātājs pārvieto uz leju pa papīru no šķīdinātāja rezervuāra trauka augšpusē. Tādā veidā var eluēt atsevišķas sastāvdaļas.
Papīra hromatogrammu izstrāde principā neatšķiras no tās, kas aprakstīta plānslāņa hromatogrammām.
Papīra hromatogrāfijas efektivitāte ir atkarīga gan no papīra veida, gan kustīgās fāzes sastāva. Papīra markas atšķiras pēc porainības, biezuma, hidratācijas pakāpes. Pēc kustības ātruma šķīdinātāji izšķir ātru, vidēju un lēnu papīru. Visizplatītākie hromatogrāfisko papīru veidi ir Ļeņingradas, vatmanas u.c.
Visizplatītākās šķīdinātāju sistēmas ir: CH3COOH-H2O (15:85 tilp.), 1-butanols - CH3COOH-H20 (4:1:5), 2-propanols - NH3 (konc.) - H2O (9:1:2) , 1 -butanols - 1,5 n. NH3 (1:1), fenols - ūdens utt. Kustīgās fāzes sastāvs parasti tiek izvēlēts eksperimentāli vai pamatojoties uz datiem, kas sniegti rokasgrāmatās vai monogrāfijās par papīra hromatogrāfiju.
Jonu apmaiņas papīra izmantošana ļauj apvienot papīra hromatogrāfijas un jonu apmaiņas priekšrocības. Šādu papīru iegūst, sajaucot jonu apmaiņas sveķus ar celulozi, ko izmanto papīra ražošanai.
Papīra hromatogrāfijai ir liela nozīme kvalitatīvajā analīzē. Tā izmantošana kvantitatīvā analīzē ir ierobežota.
Papīra hromatogrāfija. Jau no pirmā vārda jūs saprotat, ka tas ir kaut kas saistīts ar papīru; un otrais vārds "hromatogrāfija" nozīmē "krāsa" (hroms) un "rakstīt" (grafika). Salokiet tos uz augšu, un jūs saņemsiet "rakstīt krāsu uz papīra".
Papīra hromatogrāfija ir vissvarīgākais tests zinātnē. Rūpīgi analizējot ķīmiskās vielas sastāvu pēc krāsas, zinātnieks var viegli identificēt izejvielas. Ir viegli redzēt, ka hromatogrāfija, kuru patiešām ir vērts pētīt, darbojas tieši caur kapilāro efektu - veidu, kā ūdens izplatās papīrā.
Kolonna - satur hromatogrāfisko sorbentu, veic maisījuma sadalīšanas funkciju atsevišķos komponentos. Eluents – kustīgā fāze: gāze, šķidrums vai (retāk) superkritisks šķidrums. Stacionārā fāze - cieta fāze vai šķidrums, kas saistīts ar inertu nesēju, adsorbcijas hromatogrāfijā - sorbents. Hromatogramma ir rezultāts, reģistrējot komponentu koncentrācijas atkarību no kolonnas izejas laikā. Detektors - ierīce maisījuma komponentu koncentrācijas reģistrēšanai kolonnas izejā. Hromatogrāfs - ierīce hromatogrāfijai.
Lejupvērsta hromatogrāfija Metode, kurā kustīgā fāze virzās uz leju Augšupvērsta hromatogrāfija Metode, kurā kustīgā fāze virzās uz augšu Horizontālā hromatogrāfija Metode, kurā kustīgā fāze pārvietojas horizontāli Apļveida hromatogrāfija Metode, kurā kustīgā fāze pārvietojas no apļa centra uz tā apkārtmēru, kurā kustīgās fāzes virzīšanās uz priekšu turpinās pēc tam, kad priekšpuse sasniedz papīra beigas. Re-hromatogrāfija Metode, kurā pēc pirmās kustīgās fāzes virzīšanas pabeigšanas hromatogrammu žāvē un hromatogrāfiju atkārto (dažreiz vairākas reizes). Metode vielu noteikšanai uz hromatogrammas Nesējs hromatogrāfiskais papīrs
Stacionārā (stacionārā) fāze Fāze, kas fiksēta uz nesēja Mobilā (mobilā) fāze Fāze, kas nodrošina atdalāmo vielu kustību uz nesēja ar stacionāru fāzi Sākuma vieta, kur tiek uzklāts testa paraugs
Papīra hromatogrāfijā tiek izmantotas īpašas, pēc skaita atšķirīgas papīra markas, kurām palielinoties, palielinās papīra blīvums. Papīrs aiztur ūdeni porās, kas ir stacionāra šķidrā fāze. Parauga šķīdumu pilienu veidā uzklāj uz papīra lapas noteiktā attālumā no malas. Pēc šķīdinātāja iztvaikošanas loksnes malu ievieto noslēgtā kamerā, kurā atrodas attīstītājs - kustīgā šķidrā fāze (piemēram, spirti, ketoni, fenoli, tetrahlorogleklis, hloroforms un citi to maisījumi, kā arī maisījumi ar neorganiskām šķīdinātāji). Šajā gadījumā sākotnējā vieta pārvietojas pa attīstītāja strāvu, un maisījums tiek sadalīts komponentos. Ja vielas nav krāsotas, tad hromatogrammu izstrādā, piemēram, izsmidzinot ar indikatora šķīdumu, pārbauda ultravioletajos staros utt. Attāluma Rf attiecība, ko nobrauc plankums I pret attālumu, ko nobrauca priekšpuse. izstrādātājs m, tādos pašos eksperimenta apstākļos, ir nemainīga vērtība; Rf dažādām vielām atšķiras pēc vērtības, un to var izmantot savienojumu identificēšanai.
Klasifikācija Papīra hromatogrāfiju, kā arī hromatogrāfiju kopumā, var iedalīt sadalošajā adsorbcijā Normālā (metode tiek izmantota lipofilu vielu atdalīšanai.) jonu apmaiņas apgrieztās fāzes preparatīvā analītiskā.
Dažādu vielu kvantitatīvās noteikšanas hromatogrammas plankumos tiek veiktas ar tradicionālajām analītiskajām metodēm. Ir: viendimensijas, divdimensiju, apļveida, kolonnu un elektroforētiskās hromatogrammas.
I. Adsorbcijas hromatogrāfijas pamatā ir analizējamā maisījuma atsevišķu komponentu selektīva adsorbcija ar atbilstošiem adsorbentiem. Strādājot ar šo metodi, analizētais šķīdums tiek izvadīts caur kolonnu, kas piepildīta ar smalkiem adsorbējošiem graudiņiem. Adsorbcijas hromatogrāfiju izmanto, lai atdalītu neelektrolītus, tvaikus un gāzes. II. Sadalīšanās hromatogrāfija balstās uz analizējamā maisījuma atsevišķu komponentu sorbcijas koeficientu starpības izmantošanu starp diviem nesajaucamiem šķidrumiem. Viens no šķidrumiem (stacionārs) atrodas porainās vielas (nesēja) porās, bet otrais (mobilais) ir cits šķīdinātājs, kas nesajaucas ar pirmo.
Šis šķīdinātājs tiek izvadīts caur kolonnu ar mazu ātrumu. Dažādas sadalījuma koeficientu vērtības nodrošina atšķirīgu maisījuma sastāvdaļu kustības ātrumu un atdalīšanu. Vielas sadalījuma koeficients starp diviem nesajaucamiem šķīdinātājiem ir vielas koncentrācijas kustīgā šķīdinātājā attiecība pret tās pašas vielas koncentrāciju nekustīgā šķīdinātājā:
Dažreiz kolonnas vietā kā nekustīga šķīdinātāja nesēju izmanto filtrpapīra sloksnes vai loksnes, kas nesatur minerālu piemaisījumus. Šajā gadījumā testa šķīduma pilienu uzklāj uz papīra sloksnes malas, kas ir pakārta slēgtā kamerā, nolaižot tās malu ar pilienu testa šķīduma, kas uzklāts traukā ar mobilu šķīdinātāju ( motors), kas, pārvietojoties pa papīru, to saslapina. Šajā gadījumā katra analizētajā maisījumā esošā viela pārvietojas ar tai raksturīgo ātrumu tajā pašā virzienā kā virzītājspēks.
īpašs veids sadalīšanas hromatogrāfija ir gāzu šķidruma hromatogrāfija (GLC). Kā stacionāro fāzi izmanto dažādus negaistošus šķidrumus, kas balstīti uz inerta cieta nesēja; kā kustīgā fāze, gāzveida slāpeklis, ūdeņradis, hēlijs, oglekļa dioksīds utt. Maisījumu atdalīšana ar GLC metodi tiek veikta kolonnās, kas ir caurules ar iekšējo diametru 16 mm un garumu 15 m, pildītas ar inerts nesējs, piemēram, diatomīts, kas piesūcināts ar negaistošu šķidrumu, vai tērauda un stikla kapilāri ar diametru 0,2 0,3 mm un garumu 25 100 m ar šķidru fāzi, kas nogulsnēta uz šo kapilāru sieniņām (kapilārā gāze). - šķidruma hromatogrāfija).
. Jonu apmaiņas hromatogrāfijas pamatā ir jonu apmaiņas procesu izmantošana, kas notiek starp mobilajiem adsorbcijas joniem un elektrolīta joniem, kad analizējamās vielas šķīdums tiek izvadīts caur kolonnu, kas piepildīta ar jonu apmaiņas vielu (jonu apmaiņas vielu). Jonu apmaiņas līdzekļi ir nešķīstoši neorganiski un organiski lielmolekulāri savienojumi, kas satur aktīvās (jonu) grupas. Šo grupu mobilie joni, saskaroties ar elektrolītu šķīdumiem, var tikt apmainīti pret izšķīdušās vielas katjoniem vai anjoniem. Kā jonu apmainītāji tiek izmantoti alumīnija oksīds (hromatogrāfijai), permutīns, sulfonētas ogles un dažādas jonu apmaiņas vielas, jonu apmaiņas sveķi. Jonu apmaiņus iedala katjonu apmaiņas spējīgos (tos satur aktīvās grupas: SO 3 H, COOH, OH); anjonu apmaiņas iekārtas, kas spēj veikt anjonu apmaiņu (aktīvās grupas: NH 2, =NH); amfolīti ir jonu apmaiņas vielas ar amfoteriskām īpašībām.
IV. Sedimentārās hromatogrāfijas pamatā ir dažādu analizējamā maisījuma komponentu veidoto nogulšņu atšķirīgā šķīdība ar īpašiem reaģentiem, kas uzklāti uz ļoti izkliedētu vielu. Analizētos šķīdumus izlaiž caur kolonnu, kas piepildīta ar porainu vielu (nesēju). Nesējs ir piesūcināts ar izgulsnēšanas reaģentu, kas veido nogulsnes ar šķīduma joniem, kuriem ir atšķirīga šķīdība. Iegūtās nogulsnes, atkarībā no šķīdības, ir sakārtotas noteiktā secībā pa kolonnas augstumu.
V. Izmēru izslēgšanas (molekulārais siets) hromatogrāfijas pamatā ir komponentu molekulu atšķirīgā caurlaidība pret stacionāro fāzi (ļoti porains nejonu gēls). Izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju iedala gēla caurlaidības hromatogrāfijā (GPC), kurā eluents ir neūdens šķīdinātājs, un gēla filtrācijā, kur eluents ir ūdens.
Ieliekot pilienu sarkanās un zilās tintes maisījuma samitrinātas filtrpapīra loksnes centrā un uzmanīgi nopilinot tīru ūdeni, jūs drīz iegūsit tieši tādu pašu attēlu. Zemāk ir sešu dažādu aminoskābju kompleksa maisījuma gredzena hromatogramma uz papīra,
izstrādāti ar četriem dažādiem reaģentiem. Augšējā labajā pusē ir vēl sarežģītāka četrpadsmit dažādu aminoskābju maisījuma 2D hromatogramma. Šo hromatogrammu ieguva no viena piliena skābju maisījuma šķīduma, kas tika uzklāts uz punktu, kas norādīts ar apli. Izstrāde tika veikta pārmaiņus divos virzienos ar dažādiem reaģentiem. Katra etiķetes vieta pieder vienai aminoskābei. Pēc plankuma krāsas un stāvokļa var pilnīgi precīzi noteikt vielas raksturu. Augšējā kreisajā pusē - parastas tintes traipa hromatogramma uz blotpapīra.
Hromatogrammu izstrāde Hromatogrammas komponentu izstrādi veic ar vienu no tālāk norādītajām metodēm. Fizikālās metodes (Vizuāli dienas gaismā hromatogrammā tiek atzīmēts krāsainu vielu plankumu novietojums. Fluorescējošu vielu klātbūtnē tiek veikta attīstīšana UV gaismā.) Ķīmiskās metodes (Hromatogrammas tiek izstrādātas ar šķidriem un gāzveida attīstītājiem, izmantojot hromatogrammā esošo savienojumu reakcija ar piemērotu attīstītāja reaģentu, veidojot krāsainu vai fluorescējošu vielu (šķidros izstrādātājus uzklāj ar smidzināšanas pudeli vai izmanto aerosola reaģentus, gāzveida reaģentus izmanto, ievietojot hromatogrammu tvaikos). izstrādātājs.)
Hromatogrammu novieto horizontāli uz filtrpapīra loksnes vai atstāj uzkarinātu uz stikla stieņa un apsmidzina ar pēc iespējas mazākiem attīstītāja pilieniem (miglu) visā hromatogrammas laukumā, vispirms no vienas puses un pēc tam no otra puse. Izstrādājot ar gāzveida attīstītāju, hromatogramma tiek suspendēta kamerā, kurā ievietots gaistošs reaģents (piemēram, joda kristāli), vai arī kuras apakšā ķīmiski iegūts attīstītājs (piemēram, slāpekļa oksīdus iegūst, pievienojot cietais nātrija nitrīts sālsskābes šķīdumā).
Bioloģiskās metodes Hromatogrammas tiek izstrādātas, izmantojot hromatogrāfisko vielu bioloģisko aktivitāti. Hromatogrammas kvalitatīvais novērtējums ir plankuma vai joslas stāvokļa noteikšana, ko raksturo R f=a/b vērtība, kur a ir attālums no parauga plankuma centra līdz sākuma līnijai, mm; b ir attālums no šķīdinātāja frontes līdz sākuma līnijai, mm vai pēc Rx vērtības: Rx= a/c, kur c ir attālums no etalonvielas punkta centra līdz sākuma līnijai, mm.
Vēlamās sastāvdaļas daudzuma noteikšanu paraugā veic, salīdzinot tā plankuma izmēru un krāsas intensitāti ar standartvielas plankumiem, kas uzklāti uz papīra koncentrāciju diapazonā, kas norādīts normatīvi tehniskajā dokumentācijā pārbaudītajam reaģentam un apstrādāti testa apstākļos. Novērtēšana tiek veikta vizuāli vai ar aparatūras palīdzību (piemēram, densitometru, ierīci komponentu plankumu skenēšanai uz papīra), vai arī ar plankumu eluēšanu un sekojošu šķīdumu optiskā blīvuma fotometrisku noteikšanu. Hromatogrammas tiek glabātas apstākļos, kas novērš savstarpēju hromatogrammu nospiedumu parādīšanos (piemēram, ar filtrpapīra spilventiņiem). Ja plankumu raksturs atļauj, tad uz hromatogrammām tiek uzklāts ātri žūstošas lakas slānis. Ja nepieciešams, uzzīmējiet hromatogrammas vai fotogrāfijas kontūru.
PAPĪRA HROMATOGRĀFIJAS IEKĀRTU PIEMĒRI UN KĀ TO IZMANTOT Augšupvērsta un lejupvērsta hromatogrāfijas kamera 1. Augšupvērsta un lejupvērsta hromatogrāfijas kamera (1. att.) Att. 2. Kamera horizontālajai hromatogrāfijai (2. att.) (2. att.) 1 kamera; 2 stikla stieņu režģis; 3 stikla stienis hromatogrammas gala nospiešanai; 4 vāks; 5 hromatogramma; 6 šķīdinātājs
Smuki. 3. Kamera apļveida hromatogrammai (divas Petri trauciņi) (3. att.) 1 papīra dakts; 2, 4 Petri trauciņi; 3 apļveida hromatogramma; 5 šķīdinātājs 4. Hromatogrammas pozicionēšanas veidi augošā hromatogrāfijā (4. att.) 1 hromatogramma; 2 hromatogrāfijas kamera; 3 šķīdinātājs
Smuki. 5. Metode papīra hromatogrammas ievietošanai rievas 1. hromatogrammā; 2 starts; 3 stikla stienis; 4 saliekta nūja hromatogrammas iespiedīšanai rievā; 5 rieva
Divdimensiju hromatogrammu iegūst, atdalot viendimensijas hromatogrammas plankumus ar citu izstrādātāju virzienā, kas ir perpendikulārs pirmajai plankumu rindai. Apļveida hromatogrammā plankums, kas novietots lapas centrā, ir izplūdis gar koncentriskiem apļiem. Papīra kolonnu hromatogrāfijā atdalīšanu veic uz papīra diskiem, kas ir cieši ievietoti cilindriskā kolonnā. Lai iegūtu elektroforētiskās hromatogrammas, papīra loksni piesūcina ar elektrolītu, fiksē starp elektrodiem, uzklāj analizēto maisījumu, elektrodus pievieno avotam. līdzstrāva un tajā pašā laikā uz papīra tiek uzklāts kustīgs šķīdinātājs virzienā, kas ir perpendikulārs virzienam spēka līnijas elektriskā strāva.
Šajā metodē komponentu atdalīšana notiek to nevienlīdzīgā sadalījuma dēļ starp divām šķidrajām fāzēm un atšķirīgs ātrums vielu kustība darbības laikā elektriskais lauks. Papīra hromatogrāfiju izmanto, lai atdalītu un analizētu neorganiskās un organiskās vielas dabas un rūpnieciskos materiālos (piemēram, noteiktu sveķus naftas produktos, retzemju elementus iežos un minerālos).
Hromatogrāfijas metodes ir neaizstājamas pārtikas kvalitātes kontrolē. uzturvērtība Produktus nosaka, analizējot olbaltumvielu aminoskābju sastāvu, taukskābju un glicerīdu izomēro sastāvu taukos, ogļhidrātos, organiskajās skābēs un vitamīnos. AT pēdējie gadi daudzas no šīm analīzēm tiek veiktas, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju. Lai novērtētu produktu drošumu, tajos tiek konstatētas pārtikas piedevas (konservanti, antioksidanti, saldinātāji, krāsvielas u.c.), tiek noteikts produktu svaigums, agrīnās stadijas bojāšanās un pieļaujamais glabāšanas laiks.
Pārtikas produktos ar hromatogrāfijas metodēm var noteikt tādus piesārņotājus kā pesticīdus, nitrozamīnus, mikotoksīnus (aflatoksīnus, ohratoksīnu A, zearalenonu u.c.), polinukleāros aromātiskos savienojumus, biogēnos amīnus, nitrātus utt. Iespiešanās dēļ iespējama arī pārtikas produktu piesārņošana. kaitīgās vielas no iepakojuma materiāliem, jo īpaši vinilhlorīds, benzols, plastifikatori utt. gaļas produkti identificēt anaboliskos steroīdus, hormonus un citus farmaceitiskos preparātus, kurus parasti ļaunprātīgi izmanto intensīvā lopkopībā. Atsevišķa gāzu hromatogrāfijas pielietojuma joma ir pārtikas produktu aromāta sastāva analīze. Tika atrasti tūkstošiem gaistošu komponentu, no kuriem tikai daži desmiti nosaka smaržas raksturu, pārējās piešķir produkta smaržai un garšai individualitāti.
Pēdējos gados ir parādījies jauns virziens - pārtikas sastāvdaļu enantioselektīva analīze. Pēc attiecības optiskie izomēri aminoskābes, hidroksi skābes un daži citi savienojumi, var nepārprotami noteikt, vai konkrētais produkts ir dabīgs vai satur sintētiskus imitatorus un piedevas. Enantiomēru analīze parādīja, ka pārtikas produktu mikroviļņu apstrāde, atšķirībā no smagas termiskās apstrādes, neizraisa aminoskābju racemizāciju. Tomēr visi fermentācijas procesiem pakļautie piena produkti satur daudz (netoksisku) D-alanīna un D-asparagīnskābes, pienskābes baktēriju atkritumproduktus.
Dabiskajos taukos dominē taukskābju cis izomēri. Nesen tika atklāts, ka trans-izomēri palielina ZBL un samazina augsta blīvuma lipoproteīnu līmeni asinīs, kas var veicināt aterosklerozes attīstību. Gāzu hromatogrāfiskās atdalīšanas un visu taukskābju izomēru analīzes tehnikas izstrāde lika ražotājiem vairākas reizes samazināt trans-izomēru saturu. nepiesātinātās skābes margarīnā.
Dažos sieros ar gāzu hromatogrāfiju ir identificēti daudzi nevēlami fizioloģiski aktīvi biogēni amīni, un šie sieri ir aizliegti. Japānā pārtikā izmanto L-triptofānu, ko iegūst, izmantojot gēnu inženieriju un biotehnoloģiju. Un, kad tūkstošiem cilvēku tika diagnosticēta iepriekš nezināma slimība un desmitiem slimnieku nomira, ar hromatogrāfijas metodēm tika noskaidrots, ka šīs traģiskās sekas izraisīja toksisko piesārņotāju klātbūtne triptofānā (konstatēti 60 piemaisījumi). Vīni, konjaki un citi spirtu saturoši produkti tiek pakļauti gāzu hromatogrāfiskajai analīzei.
Tagad atgriezieties pie viltošanas sviests. Ir tāda eļļa - "Zemnieks". Izskatās pēc eļļas kā eļļas. Smaržo pēc sviesta. Garšīgi. Sākumā tika nolemts pārbaudīt, cik daudz triglicerīdu tas satur. Īstajā eļļā triglicerīdi pēc svara ir lielākā daļa no visiem lipīdiem. Vidēji - 98%. Mēs izmantojam plānslāņa hromatogrāfijas metodi verifikācijai. Mēs izmantojam Sorbfil plāksnes. Hromatogrāfiskā sistēma ir visvienkāršākā - benzols.
Sadalījuma hromatogrāfija balstās uz atdalāmo komponentu īpašību, lai tās sadalītos atšķirīgi starp divām nesajaucāmām vai vāji sajaucamām šķidruma fāzēm. Viena no šķidrajām fāzēm ir stacionāra fāze, tā ir stingri noturēta uz cietas vielas - "nesēja" - virsmas monomolekulāra šķidruma slāņa veidā. Otrā fāzē - mobilajā - izšķīdina testa maisījumu, kas nogulsnēts uz nesēja.
Hromatogrāfijas procesā maisījuma vielas tiek pārdalītas starp divām nesajaucamām šķidrām fāzēm. Atsevišķu komponentu kustības ātrums ir atšķirīgs, kas ļauj tos atdalīt no sarežģīta maisījuma. Pētniecības praksē visplašāk tiek izmantota sadalīšanas hromatogrāfijas metode uz papīra.
Sadalījuma hromatogrāfija uz papīra. Nesējs ir gaisa sauss filtrpapīrs, un tajā esošais higroskopiskais ūdens ir stacionārā fāze. Kā kustīgā fāze tiek izmantoti organiskie šķīdinātāji, kas nesajaucas vai daļēji sajaucas ar ūdeni.
Iegūstot hromatogrammas ar papīra hromatogrāfijas metodi, uz filtrpapīra sloksnes malas uzpilina testa šķīduma pilienu, pēc tam sloksni iegremdē stikla vannā, kas īpaši paredzēta hromatogrāfijai, kurā ir kustīgs šķīdinātājs. Šķīdinātājam pārvietojoties pa papīru, pārvietojas arī atsevišķas maisījuma sastāvdaļas, taču ar dažādu ātrumu, kas nodrošina maisījuma atdalīšanu.
Hromatogrammas iegūst noslēgtās kamerās atmosfērā, kas piesātināta ar organiskā šķīdinātāja un ūdens tvaikiem. Iegūtās hromatogrammas žāvē un atdalīto vielu attīstīšanai apsmidzina (attīsta) ar reaģentu, kas ar izolētām vielām veido krāsainus savienojumus, kas ļauj noteikt to atrašanās vietu uz papīra strēmeles. Noteiktos eksperimenta apstākļos atsevišķu vielu sadalījumu abās šķidrajās fāzēs raksturo nemainīgs koeficients Rf.
Izkliedes koeficientu Rf nosaka pēc testa šķīduma nobrauktā attāluma (cm) un šķīdinātāja nobrauktā attāluma (cm). Rf vērtību reproducējamība ir atkarīga no veicamā pētījuma apstākļiem (papīra kvalitāte, šķīdinātāju tīrības pakāpe, temperatūra, gāzveida atmosfēras sastāvs utt.).
Ir vairāki papīra hromatogrāfijas varianti: augšupejošs - šķīdinātājs virzās no apakšas uz augšu, lejupejošs - šķīdinātājs virzās no augšas uz leju un radiāls (apļveida) - šķīdinātājs virzās no centra uz apli. Turklāt tiek izmantota viendimensiju un divdimensiju hromatogrāfija; viendimensijas hromatogrāfijā vielu atdalīšana tiek veikta vienā virzienā, divdimensiju - divos savstarpēji perpendikulāros virzienos.
Viendimensijas hromatogrāfija. Viendimensijas hromatogrāfija ir visvienkāršākā un tiek izmantota vienkāršu maisījumu pētīšanai, vielas tīrības pārbaudei, vielu identificēšanai.
Izmantojot viendimensijas hromatogrāfiju, noteikšanas procedūra ir šāda. Noteiktu daudzumu testa šķīduma uzklāj uz hromatogrāfiskā papīra sloksnes vairāku centimetru attālumā no malas. Papīru ievieto šķīdinātāja vannā kamerā, izmantojot hromatogrāfiju augšpusē vai lejup (11. attēls). Šajā gadījumā šķīdinātājs virzās uz priekšu un, kad līdz beigām paliek aptuveni 2 cm, process tiek apturēts, hromatogramma tiek izņemta no kameras, šķīdinātāja fronte tiek iezīmēta un žāvēta 100 ° C temperatūrā, lai noņemtu šķīdinātāju.
Hromatogrammu izstrādā, apstrādājot ar īpašu reaģentu, un atbilstoši izveidoto krāsaino plankumu atrašanās vietai hromatogrammā noteiktai vielai nosaka Rf, ņemot vērā attālumu no šķīduma uzklāšanas sākuma punkta līdz šķīduma vidum. atbilstošā vieta. Pēc tam, izmantojot īpašas tabulas, var noteikt, kura viela (piemēram, kura aminoskābe) atbilst plankumam. Parasti vielu identificēšanai izmanto vienlaikus iegūto zināmo vielu hromatogrammu - “lieciniekus”. Pēc šo hromatogrammu plankumu atrašanās vietas sakritības tiek noteikta vielu identitāte.
Divdimensiju hromatogrāfija. Divdimensiju hromatogrāfiju izmanto, lai atdalītu sarežģītus maisījumus, piemēram, lai raksturotu aminoskābes, kas iegūtas proteīna hidrolīzē. Šī hromatogrāfijas metode sastāv no tā, ka vielu atdalīšanu veic divos posmos, izmantojot divus šķīdinātājus savstarpēji perpendikulāros virzienos.
Radiālā (cirkulārā) hromatogrāfija. Radiālajai hromatogrāfijai izmanto apaļus filtrus, kurus ar vienkāršu zīmuli sadala vairākos vienāda izmēra sektoros un novelk divus apļus - vienu 1 - 1,5 cm attālumā no centra un otru attālumā no centra. 5 cm Uz pirmā apļa līnijas (sākotnēji) katrā sektorā uzklāj testa šķīduma pilienus, un otrais aplis ir hromatogrammas robeža. Papīra diska centrā tiek izveidots caurums, tiek ievietots papīra dakts, kas tiek iegremdēts šķīdinātājā.
Paceļoties pa papīra dakts, šķīdinātājs nonāk papīra diskā un, izkliedējoties cauri papīram, pārnes komponentus pilē no centra uz apkārtmēru. Kā kameras izmanto Petri trauciņus ar augstām malām. Radiālā hromatogrāfija ir vienkāršākā un ātrākā vielu hromatogrāfiskās atdalīšanas metode. Ar šo metodi tiek panākts augsts atdalīšanas efekts.
Kvantitatīvā analīzē ar papīra hromatogrāfiju papīram uzklāj noteiktu tilpumu testa šķīduma. Ja analizē šķīdumus ar zemu pētāmo vielu koncentrāciju, tad vairākas reizes uzpilina pilienus, katru reizi izžāvējot uzklāto plankumu, pēc tam tiek veikta hromatogrāfiskā atdalīšana.
Priekš kvantitatīvā noteikšana izolētām vielām izmanto šādu metodi. No iegūtās hromatogrammas izgriež sekciju, kurā atrodas izolētā viela, to eluē ar šķīdinātāju un nosaka tās koncentrāciju, izmantojot spektrofotometru vai fotoelektrokolorimetru.